荧光染色法在浅部真菌检验中的应用

齐宝全　车付彬　王丽娜

[摘要] 目的 觀察荧光染色法在浅部真菌检测中的应用效果，寻找一种高效、快速的浅部真菌检验方法。 方法 对169例2017年9月～2018年12月联勤保障部队北戴河康复疗养中心门诊临床拟诊为浅部真菌感染的患者标本先用荧光染色法检验，然后稍微加热后换用10%KOH法进行检测，观察荧光染色法和10%KOH湿片法两种方法总的真菌检测阳性率以及对手足癣、体股癣及花斑糠疹、甲癣（指甲、趾甲）不同感染部位真菌检测的阳性率。 结果 荧光染色法真菌总的检出率为87.6%，普通10%KOH湿片法真菌总的检出率为59.8%，两种方法比较差异有统计学意义（P<0.01）;手足癣、体股癣及花斑糠疹、甲癣（指甲、趾甲）荧光染色法真菌阳性率分别是81.7%、94.6%、82.9%，而10%KOH湿片法真菌阳性率分别是46.7%、77.0%、45.7%，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 荧光染色法真菌检测技术是一种敏感性高、快捷、可靠的浅部真菌检验方法，值得推广。

[关键词] 荧光染色法;KOH湿片法;真菌直接镜检;真菌感染

[中图分类号] R756          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）34-0090-03

Application of fluorescent staining in the detection of superficial fungi

Qi Baoquan   CHE Fubin   WANG Lina

Department of Dermatology， Beidaihe Rehabilitation Center， Joint Service Support Force of People's Liberation Army， Qinhuangdao   066100， China

[Abstract] Objective To observe the application effect of fluorescent staining in the detection of superficial fungi， and to find an efficient and rapid method for the detection of superficial fungi. Methods A total of 169 patients who were diagnosed as superficial fungal infections in the outpatient clinic of Beidaihe Rehabilitation Center of the Joint Service Support Force from September 2017 to December 2018 were first tested by fluorescence staining and then heated slightly and replaced with 10%KOH. The positive rate of total fungal detection and the positive rates of fungal detection in different infection sites of tinea manuum and pedis， tinea corporis and cruris and pityriasis versicolor， tinea unguium（fingernails and toenails） were observed. Results The total detection rate of fungi by fluorescent staining was 87.6%. The total detection rate of common 10%KOH wet slide method was 59.8%. There was no significant difference between two methods（P<0.01）. The positive rates of fungal infections of tinea manuum and pedis， tinea corporis and cruris and pityriasis versicolor， tinea unguium（fingernails and toenails） were 81.7%， 94.6%， and 82.9%， respectively， while the positive rates of 10%KOH wet slide method were 46.7%， 77.0%， and 45.7%， respectively. The difference between the two groups was also statistically significant（P<0.01）. Conclusion Fluorescence staining fungal detection technology is a sensitive， fast and reliable method for detecting superficial fungi， which is worthy of promotion.

[Key words] Fluorescent staining; KOH wet slide method; Direct microscopic examination of fungi;Fungal infection

浅部真菌感染是皮肤科常见病、多发病，严重影响人民健康，及时正确地治疗该类疾病有赖于正确的诊断，真菌直接镜检是浅部真菌病诊断的重要辅助检查，10%KOH湿片法是一种常用的真菌镜检方法，虽然该方法简单，但存在视野模糊、检出率偏低的缺点，特别是甲癣检出率更低，因而易造成误诊、误治。寻找一种快捷、高效的真菌检测技术是皮肤科医师的迫切需求。近年来真菌荧光染色法逐渐应用于临床并受到一致好评。我院自2017年9月应用荧光染色法进行浅部真菌检测，取得满意效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月～2018年12月我院门诊高度拟诊浅部真菌感染患者169例为研究对象，其中皮屑标本包括手足癣60例、体股癣63例、花斑糠疹11例，甲屑标本共35例。

1.2 方法

1.2.1 荧光染色检测法  患者皮损处75%乙醇消毒后用钝刀刮取皮屑或甲屑，置于载玻片上，滴一滴荧光染色液（立特晰，江苏诺鬲生物科技有限公司生产，主要组分包括10%KOH溶液、荧光素，纯水），盖上盖玻片，轻轻加压，用滤纸或棉签吸净溢出的多余染色液，持续染色1 min，置于荧光显微镜（莱卡DM500）下观察结果，看到荧光标记的菌丝或孢子即判定为阳性[1]，记录并拍照。

1.2.2 普通10%KOH湿片检测法  荧光染色检测完毕后，同一标本间隔5 min之后稍微加热待角质充分溶解后再将该标本在普通光学显微镜（莱卡DM500）下观察结果，看到菌丝或孢子即判定为阳性，记录并拍照（因为荧光染色液中含有10%KOH，所以在普通光学显微镜下检查就等同于普通10%KOH湿片法，荧光素只有在荧光显微镜下才显色，而在普通显微镜下不显示任何颜色，所以不会对10%KOH湿片法结果产生影响）。为防止主观性偏差，此步骤换成另外一名医师进行操作。此镜检过程中保持与荧光染色法放大倍数一致。

1.3 观察指标

对60例手足癣、74例体股癣和花斑糠疹、35例甲癣（指甲、趾甲）分别用荧光染色法和10%KOH湿片法进行真菌检测，观察两种方法对不同感染部位的真菌检测阳性率及两种方法总的真菌阳性率。

1.4 统计学方法

数据用软件SPSS21.0进行统计学分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法镜下检测效果

荧光染色法镜下可观察到真菌轮廓呈亮蓝色，可看到明显的菌丝，菌丝与周围背景形成强烈反差，易于识别。普通10%KOH湿片法背景杂乱、昏暗，反差小，真菌结构不清楚，与杂质不易识别。两种方法检测效果见封三图5、图6。

2.2 两种方法真菌检测阳性率

手足癣、体股癣及花斑糠疹、甲癣（指甲、趾甲）荧光染色法真菌阳性率分别是81.7%、94.6%、82.9%，而10 %KOH湿片法真菌阳性率分别是46.7%、77.0%、45.7%，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。荧光染色法和10%KOH湿片法总的真菌阳性率分别为87.6%和59.8%，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

3 讨论

体股癣、手癣、甲癣、花斑糠疹等浅部真菌感染性皮肤病是皮肤科常见病、多发病，严重影响人民健康，这类疾病的诊断有赖于真菌的检查。常用的真菌检验方法有培养法、真菌DNA检测法、直接镜检法。培养法虽然被认为是最可靠的真菌检测法，但耗时（至少需2周才能判定结果）而且需要相关实验室设备，对实验员的技术要求较高，基层医院难以开展。真菌DNA检测法需要特殊的检验设备和较高的实验室条件要求，多数基层医院无法开展。真菌直接镜检法长期以来都是浅部真菌感染性皮肤病辅助检查的常用手段，是实验室诊断真菌感染的首要步骤，也是最快速、性价比最具优势的诊断手段[2]，这当中普通KOH湿片法开展最普遍，该方法设备简单、价格低廉，操作技术容易掌握，但KOH法需要加热，角质溶解效率低下，镜下真菌与皮屑、杂质等颜色一致，背景杂乱，不易辨认，对检验人员的技术、经验依赖较高，易导致假阴性，特别是对于甲真菌病的检出率很低，常造成临床误诊误治。

近年来逐渐兴起的荧光染色直接镜检法显示出极大优势。荧光染色法通过荧光素标记物与真菌细胞壁上的几丁质和葡聚糖共价结合[3-4]，形成荧光复合物，而角蛋白、脂质等不着色，在荧光显微镜特定的激发光波段（340～400 nm）照射下，菌丝或孢子能发出亮蓝色荧光，与背景形成强烈反差，真菌形态清晰可见，可观察到孢子的形态和菌丝的典型横隔结构，极大提高了检出率，适用于目前发现的各种致病真菌的直接涂片检查。基于镜下真菌形态特征，还可以进一步对致病真菌种类进行提示性诊断，更具临床价值[5]。该检验法为一步操作法，操作简单、省时、快速，反应时间只需数十秒钟即可完成，检验者不需要更多经验就能轻松掌握。

本研究提示手足癣、体股癣及花斑糠疹、甲癣（指甲、趾甲）的真菌检出率以及总的真菌检出率，荧光染色法都明显高于10%KOH濕片法，极大减少了误诊率。既往杜鹏等[6]研究荧光染色法和10%KOH湿片法总的真菌阳性率分别是90.6%和67.4%，徐艳等[7]研究结果则分别是80.95%和55.23%，本研究结果与上述结果相接近。其他学者研究结果虽然不完全相同，但本研究与其结论一致[8-14]，荧光染色法总的真菌阳性率和不同感染部位真菌阳性率均高于10%KOH湿片法。值得注意的是，荧光染色法对植物纤维素也可标记，玻片上、标本中可能存在少量植物纤维，可能被荧光素标记，但纤维形态不具备规则性，大小、粗细、亮度也不同，没有菌丝的分支管状结构，容易与真菌区分[15]。此外，荧光检测法需要特殊显微镜，收费标准高于普通KOH湿片法。

综上所述，荧光染色真菌检验技术具有简单、快速、高效、敏感性高的优点，值得临床推广。

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（收稿日期：2019-10-28）