I型干扰素在犬类疾病病原学及治疗方面的研究进展

胡文 冯珣 张宝宝 闫志伟 徐玉生 刘永生

（1. 甘肃警察职业学院，兰州 730046；2. 公安部南昌警犬基地，南昌 330100；3. 中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730046）

固有免疫（Innate immune responses）和适应性免疫（Adaptive immune responses）是机体免疫系统抵御外界病原微生物入侵的重要免疫学屏障。I型干扰素（Interferon，IFN）是一类在抗击病原微生物（尤其是病毒侵染）过程中发挥关键作用的免疫因子。当相关细胞因子产生后，IFN激发的信号通路通过自分泌（Autocrine）和旁分泌（Paracrine）通路发挥抗病毒作用。I型IFN主要通过抑制病毒复制来发挥直接的抗病毒活性，并且可以激活和调节机体天然免疫与适应性免疫系统的细胞免疫功能，因此I型干扰素在病毒感染早期发挥抑制作用并且可发挥长期免疫功能。自1958年，I型IFN作为抗流感病毒复制的一种免疫活性物质而被人们所关注，此后不断发现I型IFN家族成员，其中包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-κ、IFN-τ及 IFN-ω［1］，同时也阐明了I型IFN的活化机制和介导下游免疫因子生发的信号通路。值得注意的是，犬类动物的基因组中尚未发现 IFN-ζ、IFN-δ、IFN-τ及 IFN-ω编码基因的存在。随着犬类动物的进化历程，犬类IFN-α编码基因通过突变进化出了10种具有相似免疫学活性的IFN-α亚基因群以及2个无功能活性的假基因片段。这些基因与IFN-ε和IFN-κ编码基因临近，都存在于犬类细胞核中第11号染色体上［2］。早在1986年，IFN-α就已经被美国食品药品管理局批准用于临床治疗，但是大约15%的临床患者在接受IFN治疗过程中能够产生特异性抗体，从而极大削弱了IFN作为临床药物的疗效［3］。目前，I型IFN主要用于治疗晚期毛细胞白血病、肾癌、黑色素瘤、Kaposi肉瘤、慢性粒细胞性白血病和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤，同时也用于急、慢性丙型病毒性肝炎，慢性活动性乙型肝炎的临床治疗。相对于I型IFN在人类临床疾病的应用历史，特异性I型IFN用于特定动物疾病的临床治疗起步较晚，这主要受到治疗成本的限制。犬类动物作为人类的伴侣动物，特异性I型IFN对一些犬类疾病的临床治疗起步较早，这其中包括犬类中枢神经系统性疾病、犬瘟热等［4］。这种由免疫因子介导的临床治疗在犬类疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。因此，研究I型IFN在介导机体免疫反应方面所涉及的信号通路以及免疫效应，将对研发犬类疾病的IFN临床制剂具有指导性作用。

1 I型IFN的信号通路

免疫系统是通过能够感受外源DNA或者RNA的模式识别受体来检测侵入机体细胞的病原微生物，从而实现免疫细胞与机体其他类型细胞进行信息交流以及介导下游抗感染信号通路的激活。与其他免疫活动类似，IFN相关的信号通路也是依赖免疫细胞表面受体接受病原微生物在机体产生的不同信号分子信号，进而通过细胞膜来产生一系列的胞内生物化学反应。固有免疫反应（Innate immune response）可以通过病原相关模式分子（Pathogenassociated molecular pattern，PAMP）与模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）的结合而被激活。这些PRR受体包括Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、RIG样受体及MDA5受体等。这些受体是利用特定的分子接头（如MyD88分子及TRIF分子）传递信号并激活与IFN转录相关的转录因子（如IRF3、IRF7及NF-κB）进行转录的。这些转录因子从细胞质进入细胞核后能够激活I型IFN、前炎性因子与趋化因子基因的转录活性，从而产生相应的蛋白产物。通过分析不同IFN转录因子序列在不同动物体内的相似性，包括犬类动物在内的大多数哺乳动物拥有高度相似的IFN转录因子序列［5-6］，这也进一步说明现已研究发现的IFN信号的分子机制可能同样适用于犬类动物体内IFN的免疫调节过程。IFN结合到特定的细胞受体上就可以激活具有广谱抗病毒免疫通路（JAK-STAT通路）。STAT1与STAT2蛋白被磷酸化修饰后与IRF9分子结合构成干扰素刺激基因因子3（Interferon stimulated gene factor 3，ISGF3），而后入核诱导数百种干扰素刺激基因（Interferon stimulated gene，ISG）转录活化。I型IFN诱导ISG的转录，包括IRF7在内的干扰素刺激基因，与IRF3基因共同通过正反馈循环上调IFN α/β的表达，进而使机体处于对病原微生物的免疫防御状态。然而病原体在应对机体免疫系统的免疫抵抗活性过程中已经进化出了多种免疫逃避机制，包括感染犬类动物在内的许多病毒已经进化出了一套完整的免疫逃避机制来干扰ISG与IFN互作对病毒复制的影响［7］。

2 I型IFN的诱导物

在研究IFN功能活性和免疫机制的初期，研究人员利用人工合成的双链RNA对IFN的产生机制以及下游信号传递事件进行了一系列的研究。其中，分别对来源于犬类动物、灵长类动物、啮齿类动物和反刍类动物的原代肾脏细胞利用适量的poly I：C进行处理，所有细胞均能够稳定产生IFN［8］。与其他哺乳动物体细胞相比，犬类细胞对poly I：C复合物刺激所产生的免疫反应是很弱的［9］。此外，在研究人源IFN在不同物种细胞中的免疫学效应的过程发现，犬类、猫科、反刍类和偶蹄类动物源细胞均对人源IFN不敏感［10］。进一步研究发现，I型IFN的免疫学和生物学活性是严格依赖于器官组织的类型而并非是物种器官的类型［11］。诱导IFN产生来治疗感染性疾病，已经是临床治疗动物或者人类疾病的一种有效方法。在19世纪70年代，盐酸替络龙（Tilorone hydrochloride）已经在病毒感染小鼠模型中作为一种口服IFN激活剂来进行使用。此后，在不同的动物模型中发现，这种诱导刺激物在增强NK细胞活性、抑制纤维化、抗炎症和抗肿瘤方面都有很好的效果［12］。盐酸替络龙已经在人类感染流感病毒、肝炎病毒以及疱疹病毒中被选为临床治疗药物。虽然此类IFN诱导剂并没有在家畜疾病的临床治疗中使用，但是在缓解犬类和猫科动物异体移植方面所产生的排异反应方面的治疗运用较广［13］。研究还发现中药玉屏风散的活性成分可以有效激活犬肾细胞的IFN免疫活性，从而有效抵抗流感病毒的侵染［14］。这一研究成果为临床兽医利用传统中医药对犬类疾病进行临床治疗提供了有价值的参考信息。

3 重组I型IFN的作用

在研究犬类动物免疫学分子机制初期，重组人源IFN（Recombinant human IFN）作为免疫激动剂来进行相关分子机制的研究。研究发现重组人源IFN可以对犬类动物产生剂量依赖性的B细胞分化抑制效应以及提高T细胞的免疫活性，进而使细胞大量分泌IL-2［15］。重组人源IFN能够抑制犬类细胞的体外增殖分化，并且有效抑制单纯疱疹病毒在犬类细胞中的增殖，然而其他动物源性的IFN（例如猪源IFN、鸡源IFN和鼠源IFN）均无法刺激犬类细胞产生针对单纯疱疹病毒侵染的抗病毒活性［16］。研究人员已经在大肠杆菌中实现了重组犬源IFN 的活性表达，其表达产物可以激活鼠成纤维细胞和神经元细胞的JAK-STAT信号通路［17］。随着对犬源IFN表达系统的建立及优化，实现了大肠杆菌作为表达系统将带有不同标签的重组犬源IFN高效表达，并且这些具有活性的犬源重组IFN表达产物具有针对犬类病毒病良好的临床治疗效果［18］。令人振奋的是，重组犬类IFN-ε似乎具有相对广泛的宿主嗜性抗病毒功能，不仅对同源/异源犬肾细胞还是对HeLa细胞和猫肾细胞都具有良好的抗病毒功能，这些研究结果为利用重组犬源IFN-ε作为临床制剂提供了理论依据［19］。

4 犬源I型IFN及ISG的免疫学功效

I型IFN的生物学功能主要体现在调节细胞增生与分化、参与机体免疫反应、抑制血管再生以及激活细胞凋亡［20］。I型IFN激活固有免疫与适应性免疫反应，从而提高抗原递呈、细胞因子与趋化因子生成的能力、提升B细胞抗体合成量、T细胞与自然杀伤细胞的免疫效应［21］。由于I型IFN具有抑制多种细胞的内吞作用（由此可以阻止很多胞内菌或者具有内化作用的病毒侵入），因此临床上已经广泛用于慢性丙型肝炎及癌症的治疗。在犬类疾病的临床治疗过程中，人们发现犬骨髓、脾脏、胸腺、胸腺及淋巴结相关的细胞均可在体外培养条件下由病毒或者非病毒诱导物刺激产生I型IFN［22］。犬感染犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）16 d后仍然可以在中枢神经系统检测出I型IFN的存在，这也就为临床上评估患犬是否持续性感染CDV提供了免疫学标识。而小鼠实验研究发现，中枢神经系统中的星型胶质细胞、室管膜细胞和神经元都具有分泌I型IFN的免疫学功能［23］。在犬渐进性青光眼的诊疗中，I型IFN等相关免疫因子的基因表达及转录水平的分子检测也已经有了新的进展。

此外，ISG在犬类免疫反应的过程中同样发挥着决定性作用，研究人员对ISG的研究主要集中在犬源黏液病毒抗性蛋白（Myxovirus resistance protein，Mx）与 2’，5’-寡腺苷合成酶（2’，5'-oligoadenylate synthetase，OAS）的免疫活性功能。犬源Mx1蛋白与Mx2蛋白主要定位于细胞膜。与人源Mx2蛋白相比，犬源Mx2蛋白通过颗粒样聚集而非游离的形式插入细胞膜来进行抗病毒反应［24］。犬源Mx蛋白具有广泛的抗感染作用，主要表现在抗病毒、抗原生质致病微生物、抗霉菌及特发性犬脑炎引起的神经紊乱。虽然犬源Mx蛋白的抗感染的机制还不是很清楚，但是参考人源Mx蛋白的作用机制不难发现Mx蛋白通过与病原微生物结合或者干扰病原微生物的相关转录过程来发挥抗感染的免疫学功能［25］。犬源OAS可以识别双链RNA并激活RNaseL蛋白的活性，从而降解病毒转录物以及阻止病毒蛋白的合成。研究发现雌性比格猎犬在感染病原微生物后，其血清中OAS的含量比猫科动物所产生的量高出10-100倍，这也暗示了犬源OAS蛋白产物在保护犬类动物抵御致病微生物的侵袭提供了坚固的免疫防线，而OAS的这一免疫学特点尤其在犬瘟热病毒的感染中发挥着重要作用［26］。

5 I型IFN在犬类疾病临床治疗中的应用

由于IFN具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节的免疫学效应，I型IFN已经受到人类医学及动物医学的青睐。在犬多发性乳头瘤病（Canine papillomatosis）及犬脓皮病（Canine pyoderma）治疗中，I型IFN作为免疫制剂具有理想的临床疗效。利用重组人源IFN-β进行膀胱灌注的方式来进行犬膀胱癌的临床治疗发现，重组人源IFN-β对犬无临床疗效，因此需要依赖犬类IFN开展相关临床治疗的探索研究。利用犬源I型IFN来对侵入MDCK细胞的犬新孢子虫速殖子进行处理后可有效的抑制速殖子的增殖。将I型IFN制成口服制剂并且低剂量给犬灌服后，可有效降低犬口腔中引起牙周病的细菌载量，并且增强牙龈炎性反应的程度来实现抗菌活性［27］。这是因为I型IFN能够激活口腔黏膜组织中的淋巴细胞来产生内源性IFN，从而增加抗原特异CD4+与CD8+的含量。对I型IFN在比格猎犬体内药代动力学的研究表明，口服I型IFN后，比格猎犬血清中IFN的浓度低于静脉注射I型IFN后血清中所产生IFN的浓度，同理，皮下注射途径与肌注效果也只能达到静脉注射途径IFN在血清中浓度的42%。这些研究表明，IFN通过静脉注射途径更能迅速提升犬体内用于临床治疗IFN的有效浓度。鉴于I型IFN生物活性的半衰期只有大约4.5-9.5 h，建议采用静脉注射的方式对犬类疾病进行临床治疗。但是，在利用IFN作为犬类疾病的临床治疗药物的过程中也发现很多不足之处，如犬用IFN制剂的价格过高、注射所产生的IFN中和性抗体不确定性等。为降低犬类动物对外源IFN所产生中和抗体而削弱IFN的临床疗效，研究显示在IFN与他克莫司（一种免疫抑制剂）（0.1 mg/kg）联合使用的情况下，比格猎犬体内可有效抑制针对IFN的中和抗体的产生且增强T细胞的增殖分化［28］。

5.1 I型IFN作为抗癌药物的应用

早在20世纪70年代，人们就利用I型IFN所具有的抗细胞增殖的生物学特性来进行淋巴瘤、黑色素瘤与骨肉瘤治疗的临床治疗试验。这些临床试验所取得的进展也促使犬类兽医工作者利用I型IFN来临床治疗犬类肿瘤性疾病，这其中就包括了利用人源IFN与钴-60处理体外犬类肿瘤细胞的实验，且临床疗效明显。总之，IFN在体外抗肿瘤实验表明，临床用IFN对由圆形细胞瘤分化来的细胞比从实体瘤而来的细胞的临床疗效明显。利用人源IFN-α来治疗患有上皮样淋巴瘤的病犬可使病犬临床症状快速消失，并且可使疗效保持10周左右。鉴于IFN-α具有抑制血管内皮生长因子及成纤维细胞生长因子的生物学特性，IFN-α被应用于犬血管瘤的临床治疗中［29］。利用犬源IFN-β治疗犬纤维素瘤、骨肉瘤、黏液肉瘤以及脂肪瘤可以明显阻止瘤体在病灶部的复发，明显延长了患犬的生存期。在人源或者犬源黑色素瘤的体外培养物中导入IFN-β基因后，表达产物可明显增加细胞毒性作用，这为利用IFN编码基因进行临床基因治疗犬类肿瘤性疾病提供了实验依据［30］。此外，研究发现猫源IFN-ω同样对于犬类的一些肿瘤细胞具有抑制其增殖的功效。

5.2 I型IFN作为抗病毒药物的应用

在研究IFN如何抑制流感病毒复制的过程中发现，多种由I型IFN激活表达的ISG具有很强的抗病毒活性。例如，TRIM22分子促进流感病毒核衣壳蛋白的降解，MxA能够阻断核衣壳蛋白的细胞定位活性以及流感病毒基因组的复制。然而，流感病毒可以在MDCK细胞内正常增殖说明犬源Mx分子不具备抑制流感病毒复制的能力。进一步研究发现，犬源流感病毒可激活患犬体内IFN-β的合成，以及包括Mx1、Mx2、TRIM22、ISG5、DDX58及OAS1-3在内的一系列ISG基因的活性。进一步研究发现，犬流感病毒NS1通过阻断IRF3与NF-κB的信号通路来使迅速合成的IFN-β丧失抗病毒活性［31］。将重组人源IFN-α 2b滴入患犬鼻腔黏膜处，可犬流感病毒在患犬呼吸道中的增殖被有效抑制，这也为利用I型IFN针对犬呼吸道疾病的临床治疗提供了参考依据。相比流感病毒对犬类动物免疫系统的激活程度，犬乳头瘤病毒无法刺激机体产生I型IFN，由此导致的结果是与之相关的ISG无法表达以及无法活化炎性因子前体。然而利用人源IFN-α 2a对迷你雪纳瑞犬和斗牛犬进行1-2年的持续治疗后，发现由乳头瘤病毒引起的表皮色斑面积减小并且复发的几率降低。在IFN-α与病毒唑联合用药治疗后，CDV的复制被明显的抑制。虽然其中的抗病毒机制还不是十分明晰，但这种联合用药的治疗方法为治疗CDV感染提供了一种临床治疗思路。与上述犬类病毒病相比，I型IFN在犬细小病毒的临床治疗方面是最为成熟的，早在20世纪90年代人们就利用IFN-ω来进行临床治疗并取得了很好的疗效。

5.3 I型IFN在先天性疾病及免疫调节治疗方面的应用

一些研究者尝试将I型IFN具有的免疫调节功能转移到对犬类动物先天性疾病的临床治疗中。由免疫调节引起的干燥型角膜结膜炎的病犬在口服人源重组I型IFN后，临床疗效表现为患犬眼部变得湿润并且减弱了分泌物的黏滞性。利用人源重组I型IFN临床治疗复发性浅表脓皮病的患犬，也有助于减轻临床症状。特异性皮炎是犬类的过敏性疾病，这是由外界过敏原刺激犬体内IgE抗体的产生导致的，针对此类疾病的临床治疗所取得的进展对人类的这种疾病具有很好的指导意义。因为这类过敏性疾病无论是在犬还是人发生，这都是由于体内免疫相关基因的异常转录以及IFN基因相关的调节因子功能紊乱造成的［32］。有趣的是，猫源IFN-ω无论是口服还是皮下注射均对犬特应性皮炎的临床治疗中也能发挥良好的治疗作用，这可能是因为猫源IFN-ω显著提高了皮肤对瘙痒耐受能力以及降低了皮损的敏感程度［33］。

6 展望

自从I型IFN被发现以来，其卓越的抗病毒功能及免疫调节活性一直是研究的热点，并且在临床治疗研究中也具有重要的研究地位。由于其具有抗病毒、抗增生及免疫调节等功能，包括犬类动物在内的很多动物疾病均有I型IFN在临床中用于治疗的案例。然而，在诸如犬细小病毒引发的小肠炎的临床治疗过程中发现，I型IFN的实际疗效还需要通过大量动物实验进行系统评估。此外，I型IFN体外表达所产生的医学成本也是令兽医临床工作者望而却步的一个重要原因，这需要人们努力研发出成本更低廉的表达系统，以扩大期在动物疫病治疗领域中的作用。