PKGⅡ阻断EGF/EGFR通路在骨肉瘤中的研究进展*

毛良浩 综述，李大鹏，江 攀 审校

(江苏大学附属医院骨科，江苏镇江 212001)

骨肉瘤(osteosarcoma)是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于生长活跃的股骨远端和肱骨近端的干骺端[1]，耐药、复发和高转移率是治疗骨肉瘤难点所在。 自从20世纪80年代早期引入全身化疗方案以来，骨肉瘤的预后改善基本停滞，伴有远处转移尤其是肺转移的骨肉瘤患者5年生存率无法进一步提高[2-3]。

研究发现，cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(cGMP dependent protein kinase，PKGⅡ)与多种肿瘤关系密切，其可抑制神经胶质瘤、前列腺间质癌、乳腺癌、胃癌及人结直肠癌细胞的增殖和迁移，促进肿瘤细胞凋亡[4-8]。体外研究发现，高表达PKGⅡ能够明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞增殖，表现出抗肿瘤特性[9]。因此，PKGⅡ有望成为骨肉瘤等恶性肿瘤治疗的潜在靶点，其中PKGⅡ通过表皮生长因子(EGF)/表皮生长因子受体(EGFR)通路在骨肉瘤发生、发展中的研究逐渐成为焦点，本文将综述PKGⅡ阻断EGF/EGFR通路在骨肉瘤中的研究现状，为PKGⅡ靶向联合治疗骨肉瘤提供理论依据。

1 PKGⅡ

1.1结构及表达 PKG属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，已被发现将近50年，然而其调控细胞生长和凋亡方面功能近些年才被人们揭示。PKG拥有3种不同亚型，包括PKGⅠα、PKGⅠβ和PKGⅡ，广泛分布于哺乳动物细胞中，其中PKGⅡ是一种在真核细胞中发现的膜结合酶，广泛分布于脑、肾、软骨和肠道中。研究发现，PKGⅡ在肿瘤中的表达水平明显低于正常组织，表明PKGⅡ可能是一种潜在的抗癌因子[10]。

1.2活化与功能 PKGⅡ的活化依赖于环磷酸鸟嘌呤核苷激活，进而才能够作用于特定的下游底物， 发挥在肠道分泌、骨骼生长、肾素分泌、学习记忆等方面的作用。 近来有研究表明， PKGⅡ激活剂8-pCPT-cGMP是通过高选择性地与A位点具有更大的β5/β6口袋结构的PKGⅡ结合进而发挥相应功能[11]。此外，PKGⅡ可阻断EGF/EGFR通路，从而抑制其下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)介导的致癌作用。

2 EGFR

EGFR是由原癌基因表达的跨膜糖蛋白。家族包括EGFR、C-erB-2(HER-2)、C-erB-3(HER-3)、C-erB-4(HER-4)，均位于细胞膜上。研究发现，EGFR的过表达和突变与多种肿瘤的发生、发展关系密切，而PKGⅡ对EGFR的活化表达具有抑制作用，发挥潜在抗癌作用[12]。

EGFR作为一种酪氨酸激酶，通过作用于下游相关信号通路，发挥调节细胞增殖迁移、侵袭和凋亡等功能[13]。野生型的EGFR通过与配体表皮生长因子、转化生长因子α等因子结合而被激活，诱导多种基因表达。EGFR参与肿瘤细胞增殖、黏附、血管形成、转移等过程，在多种肿瘤如结肠癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤中高水平表达，目前已成为靶向抗肿瘤研究中最受关注的靶点之一。研究发现，骨肉瘤中EGFR的表达水平与其恶性程度有关，提示EGFR可能参与骨肉瘤的发病机制，可作为预后指标[14]。

3 PKGⅡ阻断EGF/EGFR通路在骨肉瘤中的生物学作用

3.1抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移 体内研究发现，骨肉瘤组织中EGFR阳性率与其生物学行为密切相关，提示 EGFR可能具有刺激介导肿瘤形成和进展的关键特性，它在肿瘤增殖和迁移中起重要作用[14]。其他研究发现EGFR及其配体参与激活PI3K/AKT通路及一种致癌转化关键分子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，促进肿瘤细胞的生长和增殖，而增加PKGⅡ表达水平，可间接抑制EGFR，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖[15-16]。体外实验表明，EGFR可以刺激ERK、AKT磷酸化，促进MG-63细胞的增殖和迁移。 而经过M8-pCPT-cGMP刺激活化的PKGⅡ能够明显抑制EGFR的活化和骨肉瘤细胞增殖、迁移及相关信号级联反应[9]。以上研究表明，PKGⅡ阻断EGF/EGFR通路在抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移方面起重要作用。

3.2诱导骨肉瘤细胞的凋亡 EGFR可促进下游MAPK/ERK及PI3K/AKT/mTOR信号通路，刺激骨肉瘤细胞的增殖和分化，抑制凋亡[15]，而增加突变的EGFR或其配体，可以进一步促进EGFR自身的持续活化并促进肿瘤细胞增殖、分化。PKGⅡ发挥作用有赖于cGMP或cGMP类似物的激活。近来，有研究已经证实了在真核细胞中存在环核苷酸cCMP和cUMP，它们可以激活PKGⅡ，使其以环核苷酸依赖性方式磷酸化特定的下游信号蛋白抑制肿瘤细胞的增殖、分化，诱导肿瘤细胞的凋亡[17-19]。另有研究发现，用PKGⅡcDNA感染的MG-63细胞，经过8-pCPT-cGMP活化后的PKGⅡ，能够明显逆转EGFR上述作用，从而诱导骨肉瘤细胞的凋亡[9]，这也进一步证明了PKGⅡ可以通过阻断EGFR相关通路诱导骨肉瘤细胞的凋亡，有望发挥抗肿瘤作用。

3.3抑制EGF诱导的EGFR相关蛋白及其下游信号通路 研究发现，用PKGⅡ转染MG-63人骨肉瘤细胞可以降低EGFR的表达[15]，进而抑制EGFR下游的PI3K/AKT和ERK途径的激活[20]。KOUSTAS等[21]发现PI3K/AKT/mTOR途径是EGFR的下游，其活化可促进肿瘤细胞生长并抑制凋亡。研究发现AKT作为EGFR下游和mTOR上游关键因子，参与调节癌细胞代谢和存活，PKGⅡ可通过阻断EGF/EGFR触发的PI3K/AKT和MAPK/ERK介导的途径来抑制癌细胞的活化，提示PKGⅡ可能是一种潜在的抗癌因子，有可能成为新型潜在的EGFR抑制剂[22]。

然而，PKGⅡ究竟如何作用于EGFR，是通过直接磷酸化抑制 EGFR核转位，还是通过某种中间通路尚不明确，其次EGFR的作用靶点及其下游介导的多种蛋白表达和功能仍有待进一步研究。

3.4抑制肿瘤血管的生成 骨肉瘤是富含血管的实体瘤，肿瘤血管的生成在其生长、侵袭和转移过程中起到关键作用，因此，抑制肿瘤血管的生成具有相关治疗前景[23]。研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)可促进血管内皮细胞生成、刺激肿瘤血管形成、增加微血管通透性等功能，是肿瘤血管生成过程中最重要的传导途径之一[24]。CASCIO等[25]发现EGF与EGFR结合，通过EGF/ PI3K/STAT3信号传导途径上调两种促血管生成因子VEGF和瘦素的表达， 从而促进肿瘤血管生成。MINDER等[26]发现EGFR可调节肿瘤微环境并诱导VEGF和白细胞介素(IL)-8的持续生成，而IL-8介导的嗜中性粒细胞可以释放基质金属蛋白酶(MMP)-9，进一步促进VEGF的持续释放及其介导的内皮细胞形成血管效应。最近，研究发现PKGⅡ与L-精氨酸(L-Arg)联合可以通过阻断EGFR相关通路的激活来抑制血管生成[27]。 因此，PKGⅡ可以通过阻断EGF/EGFR下游相关通路，抑制肿瘤血管生成，但目前针对骨肉瘤的血管靶向治疗效果并不理想，PKGⅡ/EGFR相关研究可能提供新的有效靶点，尚待进一步研究明确相关机制。

4 PKGⅡ/EGFR与肿瘤的相关研究

研究表明， PKGⅡ阻断EGF-EGFR轴和下游MAPK、PI3K和PLC，逆转 EGF诱导的 FUBP1上调和MarvelD3的下调，在胃癌中发挥抗癌作用[28]。在神经胶质瘤细胞研究中，cGMP激活的PKGⅡ可磷酸化SOX9、VASP并抑制AKT磷酸化，使得肿瘤细胞以cGMP依赖性方式停滞于G1期，从而对神经胶质瘤细胞增殖活动起到抑制作用[4]。此外，研究发现PKGⅡ可以通过MAPK/JNK通路促进乳腺癌细胞的凋亡[6]，发挥抗肿瘤作用。

大量研究表明，PKGⅡ/EGFR途径与抗肿瘤作用密切相关，这使得针对PKGⅡ/EGFR的抗肿瘤研究非常重要。

5 PKGⅡ/EGFR作为靶点相关抗肿瘤研究

靶向性是肿瘤治疗的关键所在，研究表明，舒林酸、硫化舒林酸能够通过抑制5型磷酸二酯酶(PDE5)活性，增加细胞内cGMP水平从而激活cGMP/PKG途径抑制Wnt/β-catenin途径，进而得以选择性抑制结肠肿瘤细胞生长[29]。研究发现YC-1作为一种可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)激活剂，可激活cGMP/PKG途径，增加PKGⅡ表达水平，抑制EGFR和β-连环蛋白介导的信号传导途径，而后两者都与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞存活和化疗耐药有关，增强顺铂在HNSCC细胞中的作用[30]。PhysakengoseG(PG)是从酸浆中分离出来的新型抗癌中药活性成分，可通过EGFR/mTOR信号通路诱导细胞凋亡并抑制人骨肉瘤细胞中的自噬流，此外，PG还通过线粒体途径诱导细胞凋亡并通过溶酶体功能障碍阻止自噬流，EGFR/AKT/mTOR也参与了这一过程[16]。EGFR靶向抑制剂主要是针对EGFR的单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂，随着肿瘤免疫治疗研究变得越来越热，嵌合抗原受体(CAR)T细胞即经过遗传修饰的T细胞，能够消除表达突变EGFRvⅢ的肿瘤细胞，增加对肿瘤抗原的反应性，已用于治疗胶质细胞瘤等肿瘤[31-32]。因此，PKGⅡ/EGFR有望成为抗骨肉瘤的潜在靶点，可进一步研究其在肿瘤发生、发展中的作用机制。

6 展 望

综上所述，PKGⅡ能够阻断EGF/EGFR通路抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移，诱导凋亡，抑制骨肉瘤血管的生成，阻断EGFR下游相关通路，发挥抗肿瘤作用，有助于进一步揭示骨肉瘤等恶性肿瘤发生、发展的分子机制。但目前仍有诸多问题待解决：(1)PKGⅡ抗癌机制尚不十分明确，PKGⅡ是否通过某种信号通路抑制EGFR发挥抗肿瘤作用，以及是否存在某种未知的PKGⅡ抗肿瘤新靶点；(2)EGFR目前虽在肿瘤中研究较多，并已应用于临床治疗，但在骨肉瘤治疗中是否有效，仍停留于细胞阶段，暂无相关临床治疗应用；(3)由于肿瘤发病机制十分复杂，单一靶点方式不足以有效抗肿瘤，因此可进一步研究骨肉瘤的作用机制，为PKGⅡ/EGFR等多靶点联合治疗的临床转化提供新的思路和理论依据。