基于网络药理学消积化瘀丸治疗原发性肝癌的活性成分及作用机制分析▲

陆运鑫 唐伟智 侯恩存

(1 广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科，南宁市 530011，电子邮箱yunxinlu99@163.com；2 广西中医药大学研究生院，南宁市 530001)

在我国，原发性肝癌的患病率在恶性肿瘤中仅次于肺癌、胃癌，且死亡率逐渐上升，仅次于肺癌，对人们的健康和生命造成极大威胁[1-2]。目前，原发性肝癌的主要治疗方法有肝切除术、肝移植、介入治疗、放化疗、生物靶向治疗等[3]，而中药治疗肝癌在我国具有较长的历史，并且具有多方、多靶点、不易耐药等优势[4]，其治法主要有扶正去邪、疏肝健脾、解毒化瘀、软坚散结等[5]。

消积化瘀丸由炙黄芪、党参、鹿角胶、菟丝子、山慈菇、全蝎、蜈蚣、守宫、土鳖虫、三七、蛇六谷、生牡蛎、鳖甲、炮山甲组成，具有扶正清毒、化瘀消积的作用。该方可提高免疫力，抑制肿瘤的生长，减少复发转移，可用于非小细胞肺癌、肝癌的治疗[6-7]。但消积化瘀丸治疗原发性肝癌的活性成分和作用机制仍未完全明确。网络药理学的原理是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统、综合地观察药物对疾病网络的影响，从而揭示药物协同作用于人体的规律。该研究策略的整体性、系统性特点，与中医学从整体的角度诊治疾病的理论，以及中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理殊途同归[8]。本研究将基于网络药理学，探讨消积化瘀丸多种药物的主要活性成分及其治疗原发性肝癌的机制，为消积化淤丸的临床使用提供参考。

1 资料与方法

1.1 消积化瘀丸活性成分的筛选 消积化瘀丸由黄芪、党参、鹿角胶、菟丝子、山慈菇、蛇六谷、全蝎、蜈蚣、守宫、土鳖虫、三七、牡蛎、鳖甲、炮山甲等14味中药组成，通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php )[9]、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[10]、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)[11]收集这14味中药活性成分。在TCMSP数据库中，参照文献[12]，设定生物利用度≥30%和类药性≥0. 18，筛选出符合条件的活性成分，并将多个数据库收集的活性成分进行合并去除重复。

1.2 中药活性成分靶点的预测 通过PharmMapper平台(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php)[13]查询活性成分的作用靶点信息，同时剔除非人源靶点。将活性成分的分子结构以mol2格式上传到PharmMapper平台服务器，设定返回靶点数为300，并选择药效团模型作为设定条件，提交后由该平台完成活性成分靶点的预测。提取对接分数较高的前30个靶点，经过校正和转换，得到活性成分作用的人源相关蛋白靶点。将收集到的中药活性成分以及预测的成分靶点蛋白通过Cytoscape软件制作成分-靶点网络。

1.3 原发性肝癌相关蛋白的收集 通过PubMed MeSH数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)获取原发性肝癌的关键词，主要有liver neoplasm、hepatocellular cancer、cancer of the liver。通过检索OMIM数据库(https://omim.org/)[14]、TTD数据库[15]、CTD数据库(http://ctdbase.org/)获得原发性肝癌相关蛋白，并将各个数据库获取的原发性肝癌相关蛋白合并去重。

1.4 消积化瘀丸治疗原发性肝癌靶蛋白的相互作用网络构建 为探究消积化瘀丸治疗原发性肝癌的作用机制，利用在1.2和1.3中分别收集到的人源相关靶点蛋白及原发性肝癌相关蛋白，通过VennDiagram平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作文氏图，获得相互交集的靶蛋白。通过STRING数据库(https://string-db.org/)，针对消积化瘀丸治疗原发性肝癌靶蛋白构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction ,PPI)网络图，并利用Cytoscape软件将网络图可视化[16-17]。

1.5 消积化瘀丸治疗原发性肝癌靶点的富集分析与通路分析 通过DAVID在线分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)，对PPI网络关系中的靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析。GO分析中选择生物进程、分子功能及细胞组分3项内容绘制条形图。通过KEGG Mapper平台(https://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)查找富集出来的生物通路图，并利用 OmicShare(https://www.omicshare.com/)将得到的通路分析结果进行可视化。

2 结 果

2.1 消积化瘀丸14种中药的活性成分 共收集到党参21个成分、黄芪20个成分、三七6个成分、山慈菇3个成分、菟丝子8个成分、蛇六谷(魔芋)1个成分、鳖甲1个成分、鹿角胶2个成分、炮山甲2个成分、全蝎7个成分、牡蛎6个成分、壁虎(守宫)2个成分、土鳖虫(蛰虫)1个成分、蜈蚣7个成分，见表1。

表1 消积化瘀丸14种中药的活性成分

2.2 药物活性成分的靶点及原发性肝癌相关蛋白 进一步通过PharmMapper平台反向分子对接实验，得到药物活性成分预测靶点，选取每个成分得分最高的前 30个靶点蛋白，经过校正，并剔除重复及非人源靶点后，得出消积化瘀丸的作用靶点共368个；在成分-靶点网络中，对796个靶蛋白节点进行分析，结果显示有80个靶蛋白具有10个以上相互作用的活性分子，其中度值较高的主要有硬脂酸、异黄酮、苦参碱。通过OMIM、TTD、CTD、DrugBank数据库搜索原发性肝癌相关蛋白，合并去重后获得32935个肝癌相关蛋白。

2.3 消积化瘀丸治疗原发性肝癌靶蛋白的PPI网络 通过制作文氏图获得消积化瘀丸活性成分靶点与原发性肝癌相关蛋白交集的靶蛋白365个，建立PPI网络图(见图1)，该网络包含328个节点和2 120条相互作用关系，应用Cytoscape软件插件NetworkAnalyzer进行分析，发现关键节点主要有肿瘤抑制蛋白p53、蛋白激酶B1、核转录因子激活蛋白、丝裂原活化蛋白激酶3、丝裂原活化蛋白激酶1，其中度值最高的是肿瘤抑制蛋白 p53。

图1 消积化瘀丸作用于原发性肝癌靶蛋白的PPI网络图

2.4 消积化瘀丸作用于原发性肝癌靶蛋白的GO富集分析 为更进一步了解候选靶点的作用机制，通过DAVID在线分析工具对消积化瘀丸治疗原发性肝癌的365个靶点进行GO富集分析，制作消积化瘀丸治疗原发性肝癌靶点的GO富集分析中生物过程、分子功能和细胞组成排名前20的条状图(见图2)。在生物进程中，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、对药物反应、细胞增殖负调控、细胞增殖正调控、DNA模板转录的正调控和凋亡过程的负调控排位靠前；在细胞组成中，细胞质、胞浆、浆膜排位靠前；在分子功能中，三磷酸腺苷结合、蛋白质均聚活性、同一蛋白结合、蛋白激酶结合排位靠前。

2.5 消积化瘀丸作用于原发性肝癌靶蛋白的通路分析 使用DAVID在线分析工具对消积化瘀丸作用于原发性肝癌的365个靶蛋白进行通路分析，制作20个富集靶蛋白数量最多的通路的气泡图(见图3)，颜色从绿色到红色反映了P值从大到小，节点从小到大反映了靶蛋白相关联的富集基因数量从少到多，其中富集因子值越大，其富集的程度越大。结果显示，消积化瘀丸作用于原发性肝癌的靶点主要富集于氨酰tRNA生物合成信号通路，精氨酸和脯氨酸代谢信号通路。

靶蛋白(个)

靶蛋白(个)

靶蛋白(个)

富集因子

图3 消积化瘀丸作用于原发性肝癌靶点的通路富集分析气泡图

3 讨 论

肝癌在中医归类为“积聚”“痞气”“瘕积”等疾病范畴，王文志等[18]认为，正气不足导致脏腑功能失调，邪毒内生，引起气滞血瘀、脉络闭阻是其内因；饮食不节、情志失调、外感邪气是其外因，内外因相结合，从而导致肝癌的发生。消积化瘀丸便是以扶正清毒、化瘀消积为治法，辅助治疗原发性肝癌。临床研究表明，消积化瘀丸联合经导管动脉化疗栓塞术或联合射波刀治疗原发性肝癌，均取得了显著的疗效[6,19]。

韩明等[20]通过研究观察壁虎活性单体衍生物腺嘌呤发现，腺嘌呤可显著地抑制肿瘤细胞的增殖，从而导致肝癌细胞凋亡。壁虎(守宫)是消积化瘀丸组成药物之一，而本研究结果显示腺嘌呤为消积化瘀丸治疗原发性肝癌的主要活性成分之一。此外，消积化瘀丸中的主要活性成分还有硬脂酸、异黄酮、苦参碱，主要存在于炮山甲、黄芪、菟丝子中。研究表明，硬脂酸治疗肝毒性有益[21]；异黄酮属于黄酮类化合物，其对大鼠肝癌 CBRH-7919 细胞的生长具有明显的抑制作用[22]；苦参碱在抑制人肝癌细胞株HepG2的生长中也发挥重要作用[23]。

本研究中，消积化瘀丸作用于原发性肝癌的靶蛋白主要有肿瘤蛋白p53、蛋白激酶B1、核转录因子激活蛋白、丝裂原活化蛋白激酶3、丝裂原活化蛋白激酶1。研究表明[24]，肿瘤抑制因子p53的作用涉及细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA修复、衰老和新陈代谢；蛋白激酶B则通过磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B信号通路维持细胞稳态[25]；丝裂原活化蛋白激酶3、丝裂原活化蛋白激酶1可调控细胞生长、存活和分化[26]；核转录因子激活蛋白为细胞核内重要的癌蛋白，其表达随着肝癌恶性程度的增高、分化程度的降低而升高[27]。作用于上述靶蛋白的成分有腺嘌呤、5′-羟基异丁香酚-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、组氨酸，分别主要存在于守宫、黄芪、蜈蚣中。

通路富集分析气泡图显示，消积化瘀丸治疗原发性肝癌涉及的通路主要有氨酰tRNA生物合成信号通路，精氨酸和脯氨酸代谢信号通路。参与氨酰tRNA生物合成信号通路的为消积化瘀丸组成中蜈蚣的活性成分亮氨酸、酪氨酸、组氨酸；参与精氨酸和脯氨酸代谢信号通路的为菟丝子的活性成分芝麻素，党参的活性成分蒲公英酚，蜈蚣的活性成分亮氨酸、组胺和守宫的活性成分腺嘌呤。有研究表明，氨酰tRNA生物合成信号通路中的p43因子影响细胞凋亡、血管生成、细胞分化等，而另外两种辅助因子p38和p18，分别可以抑制癌基因c-myc 的表达和参与DNA损伤修复中重要的共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia-mutated gene， ATM)、ATM与Rod 3相关蛋白激酶-p53通路[28]。精氨酸和脯氨酸代谢信号通路主要调控脯氨酸和L-精氨酸的表达，Roger等[29]发现，细胞内L-精氨酸水平升高，可改善T细胞存活、延长真核生物寿命、调节抗肿瘤活性等；而脯氨酸是一个重要的细胞代谢和生理调节剂，影响着人类和动物的营养[30]。另外，消积化瘀丸组成中守宫、蜈蚣、牡蛎、黄芪、炮山甲、全蝎、土鳖虫、三七、菟丝子均调控了常见的肿瘤经典通路丝裂原活化蛋白激酶信号通路。

综上所述，消积化瘀丸可通过调节细胞凋亡、血管生成、细胞分化、抑制癌基因表达等过程发挥多靶点、多通路的协同抗肿瘤作用。但由于遗漏一些活性成分以及对关键成分的认识不足等，本研究尚有一定的局限性。