冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清LINC01184的表达水平及其临床意义

乌宇亮 张卫萍 范力宏 王亭忠 陈 涛 白晓君

(西安交通大学第一附属医院心内科，陕西省西安市 710061，电子邮箱：13636810941@163.com)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CAD)是冠状动脉发生粥样硬化病变引起血管腔狭窄或阻塞而导致的心脏疾病[1]。CAD的发病基础是冠状动脉的粥样硬化病变，是由内皮损伤、脂质代谢异常、免疫紊乱等多重因素引起的冠状动脉处发生的慢性代偿性炎症反应，涉及血管内膜的脂质浸润、血管内皮细胞受损、单核细胞黏附侵袭、平滑肌细胞增生和胶原过度积累等[2]。内皮细胞炎症损伤和平滑肌细胞增生是动脉粥样硬化形成的关键环节，也是预防和治疗动脉粥样硬化的重要靶点[3]。胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)及其结合蛋白参与内皮细胞炎症损伤和平滑肌细胞增生[4]。高通量测序及生物信息学分析表明长链基因间非编码RNA 01184(long intergenic non-coding RNA 01184,LINC01184)可能参与IGF2通路的调节，从而影响内皮细胞和平滑肌细胞的功能。本文探讨冠心病患者血清LINC01184的表达水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年7月至2016年9月西安交通大学医学院第一附属医院心内科收治的232例接受诊断性冠状动脉造影检查的患者作为研究对象。排除标准：重度糖尿病、心肌梗死患者。根据冠状动脉造影结果将患者分为CAD组145例和对照组87例，其中CAD组冠状动脉有1支以上狭窄≥75%，男性86例，女性59例，年龄(58.2±14.8)岁；对照组冠状动脉狭窄≤25%，男性42例，女性45例，年龄(57.1±15.1)岁。两组患者一般资料比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经西安交通大学医学院伦理委员会批准，所有患者均被事先告知详情，并签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 仪器与试剂 SuperScriptⅡ逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：16064014)；SYBR Green实时定量检测试剂盒(日本TaKaRa公司，批号：RR820A)；IGF2酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，ml022801)；白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：PT158)；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：P1330)；Bio-Rad IQ5型实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；iMarkTM型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 标本采集 采集研究对象空腹外周血6 mL于含有抗凝剂的采血管中，4℃冷藏30 min，3 000 r/min离心15 min，收取上层血清，-80℃保存备用。

1.4 血清总RNA的提取 血清于冰上融化，每250 μL血清加入750 μL TRIzol，混匀，静置5 min；加入1/4体积的氯仿(250 μL)，盖紧管盖，剧烈摇晃混匀，静置10 min；4℃下12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，转移至无RNA酶的离心管中，加入等体积的异丙醇，摇晃混匀，室温静置10 min；4℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清，加1 mL 75%乙醇溶液(无RNA酶)；4℃下12 000 r/min离心10 min，弃乙醇，吸干剩余液体(避免触及沉淀)，超净工作台晾干，用20 μL无RNA酶的ddH2O溶解沉淀，核酸定量仪测定RNA的浓度和纯度。

1.5 实时定量PCR检测LINC01184的表达水平 运用SuperScriptⅡ逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用实时定量PCR检测LINC01184相对表达量，试剂为SYBR Green实时定量检测试剂盒。反转录的反应体系为20 μL，包括总RNA 1 μL，引物1 μL，5×反应缓冲液 4 μL，20 U/μL RNA酶抑制剂1 μL，10 mM dNTP混合物2 μL，逆转录酶(200 U/μL)1 μL，加ddH2O至20 μL。涡旋混匀，42℃反应60 min，70℃加热5 min结束反应，获得cDNA。取适量cDNA模板、0.4 μmol/L上下游引物，在Bio-Rad IQ5型荧光定量PCR中进行反应。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃ 20 s，55～60℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。实验重复3次，每个样本设3个副孔。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参基因。LINC01184引物序列为上游：5′-GCG GTC TTC TCT GTC TTC TTT-3′，下游：5′-CTC CTG TTC GTG TCA GCA ATA-3′；GAPDH引物序列：上游：5′-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3′，下游：5′-ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA-3′。以2-△△Ct计算LINC01184的相对表达量。

1.6 血清IGF2、IL-6，TNF-α水平检测 采用ELISA检测血清IGF2、IL-6和TNF-α的水平，按试剂盒所附说明书进行操作。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者血清LINC01184相对表达水平 对照组血清LINC01184相对表达水平为(1.00±0.38)，CAD组为(4.50±1.81)，CAD组血清LINC01184相对表达水平高于对照组(t=3.681,P=0.007)。

2.2 两组研究对象血清IGF2、IL-6和TNF-α水平比较 CAD组血清IGF2、IL-6和TNF-α水平分别为(133.2±14.1)ng/mL、(147.3±16.3)ng/mL和(154.6±15.7)ng/mL，对照组分别为(20.5±4.2)ng/mL、(18.2±3.3)ng/mL和(15.5±2.6)ng/mL，CAD组血清IGF2、IL-6和TNF-α水平均高于对照组(t=4.598、4.659、5.542，均P<0.001)。

2.3 CAD组患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平与LINC01184相对表达水平的相关性 相关性分析结果显示，CDA组患者血清LINC01184相对表达水平与IGF2、IL- 6及TNF- α水平均呈正相关(r=0.902， 0.823，0.756，均P<0.001)。见图1。

图1 CAD患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平与LINC01184相对表达水平相关性分析

3 讨 论

研究表明，遗传变异是心血管疾病发生的重要原因，40%的冠心病是遗传因素造成的[5]。人类基因组的基因只有10%编码为蛋白质，而有85%以上转录为非编码RNA，考虑可变剪接的情况下，非编码RNA数目可能是蛋白编码基因的数倍乃至数十倍[6]。长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)可在表观遗传、转录水平、转录后水平以及翻译后水平调控基因表达，其作用机制复杂，是发掘人类疾病、诊断及评估预后的标志物和治疗靶点的分子库[7]。

CAD的早期诊断对其治疗效果有重要影响，但CAD早期症状不明显，甚至无症状，早期诊断非常困难，易造成漏诊而耽误最佳治疗时机。虽然冠状动脉造影、冠脉CT血管成像检查可明确冠状动脉硬化和狭窄程度，但这些检测手段存在价格昂贵、创伤性以及放射线辐射等不足，临床上难以普及。因此，如何找到价格低廉、无创伤且无辐射的早期诊断标志物，成为CAD诊治研究的热点[8]。随着基因组学及蛋白组学的发展，循环LncRNA检测在心脏病早期诊断中的潜在价值逐渐显现，且其检测无创伤、无辐射、费用低廉，易于临床的推广和普及[9]。有研究证实循环中LncRNA H19和LIPCAR水平升高会增加冠心病发生风险[10-11]。本研究结果也显示CAD组患者血清LINC01184相对表达水平高于对照组(P<0.05)，提示LINC01184可能成为冠心病早期诊断和治疗的靶标。

炎症是CAD乃至几乎所有心血管疾病发生发展的重要推动因素，贯穿CAD发生发展的整个过程。LncRNA作为炎症反应的潜在关键调节因子，参与炎症因子基因表达的转录和转录后调控[12]。LncRNA可能作为一种转录增强子或转录抑制因子，或作为支架的分子通过与染色质重塑复合物RNA结合蛋白的相互作用，或者通过竞争性结合某些特异的miRNA起到调节炎症因子基因的转录和翻译的作用[13]。研究发现，LINC01184在多种炎症相关疾病中异常表达，如阿尔茨海默病、心血管疾病、自身免疫性疾病及代谢综合征等，而在这些疾病中LINC01184可能调节IGF2、表皮生长因子受体等多个信号通路[14]。IGF2通过结合其受体或结合蛋白而调节细胞增殖、迁移、存活。IGF2与心血管疾病的发展有关，研究证实IGF2基因参与代谢综合征、2型糖尿病以及CAD的发生发展[15]。研究发现，IGF2过表达可以导致心肌结构重塑，包括心肌肥厚、左心室增大、心律失常和低血压[16]。IL-6和TNF-α是两种经典的促炎症因子，与CAD的发生发展密切相关[17]。本研究结果显示，CAD组患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平均高于对照组，且血清LINC01184表达水平与IGF2、IL-6和TNF-α水平均呈正相关(均P<0.05)，提示LINC01184可能参与CAD病理过程中炎性反应和心肌重塑过程，但其分子机制仍需进一步研究。

综上所述，CAD患者血清LINC01184水平升高，LINC01184或可作为CAD诊断和评估预后的潜在血清标志物，但其影响CAD发展的具体作用机制仍有待进一步深入研究。