交联酶聚集体的制备及在漆酶固定化中的应用进展

韩姝然 卢磊

（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

漆酶是一种多酚氧化酶，其底物范围十分广泛，可以氧化多种酚类和非酚类有机化合物，在有机污染物降解及废水处理等方面均有广阔的应用前景［1-3］。然而，由于其生产成本高、稳定性差，易在环境中失去活性，限制了其大规模应用。利用多种方法固定化漆酶，可以有效地提高漆酶的稳定性和可重复使用性，降低使用成本，并能够通过测定其最终酶活回收率的高低来衡量其效果［4］。固定化漆酶与游离酶相比，适应的温度及pH值范围更加广泛，稳定性更好。

酶的固定化一般通过载体的共价连接、吸附或包埋来实现。近年来逐渐发展出无载体固定化技术。2000年，荷兰Delft大学的Sheldon研究组提出一种用盐、有机溶剂或非离子聚合物等沉淀剂沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再用交联剂交联的无载体固定化方法——交联酶聚集体（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）技术［5］。CLEAs技术与传统固定化技术相比，具有制备过程简便、高酶活回收率和高有机溶剂耐受性等优点，且这种方法不需要使用高纯度的酶而受到广泛关注［6］。目前已应用于包括漆酶等多种工业酶的固定化，本文对CLEAs的制备、影响因素及在漆酶固定化中的应用等方面做了介绍，为进一步研究CLEAs开发和应用提供依据。

1 制备CLEAs的影响因素

1.1 沉淀剂的种类及浓度

通常形成CLEAs包括两个步骤，首先利用沉淀剂使酶物理聚集，然后通过交联剂进一步建立酶之间的化学键。通常，在酶溶液中加入盐、有机溶剂或非离子聚合物就可以通过改变分子状态或改变溶液的静电常数来诱导蛋白质分子的聚集［7］。由于交联过程一般会导致酶活损失，因此选择效果良好的沉淀剂有助于后续工业中保持较好的酶活回收率［8］。Perzone等［9］考察了不同沉淀剂（NH4）2SO4、聚乙二醇（PEG）和正丁醇对纤维素酶活性的影响，发现PEG是最有效的沉淀剂，酶活回收率最高为29%，而使用正丁醇时会导致酶完全失活。Bilal等［10］采用丙酮、（NH4）2SO4、乙醇、2-丙醇和叔丁醇等多种沉淀剂沉淀Ganoderma lucidumIBL-05的锰过氧化物酶。其中丙酮是最有效的沉淀剂，其酶活回收率最高为31.26%。在沉淀过程中沉淀剂的浓度也会引发酶不同程度的聚集，如果浓度过高会造成酶的活性丧失，如果浓度过低，则会使酶沉淀不充分，导致酶活回收率较低。Aytar等［11］在制备CLEAs过程中用（NH4）2SO4沉淀酪氨酸酶时发现，随着（NH4）2SO4饱和度的增加，CLEAs的酶活回收率也随之提高，当（NH4）2SO4饱和度为60%时，酶活回收率达到最高，而高于60%后又逐渐降低。对于酶活较低的CLEAs来说，可能是由于使用的沉淀剂浓度不适所致，因此对沉淀剂的浓度应当做出合适的选择。

1.2 交联剂的种类、浓度及时间

交联剂主要是通过其两端的醛基和酶分子表面的赖氨酸发生共价结合以得到不溶的CLEAs。戊二醛（GA）是常见的交联剂，适用于绝大多数酶［12］。然而，还有一些酶，如腈水解酶，当使用戊二醛作为交联剂时，可能由于戊二醛尺寸小而能够进入蛋白质内部，与催化相关的氨基酸发生交联反应，导致酶失活；而当使用体积较大的多醛葡聚糖作为交联剂时，酶活回收率可达到50%-60%［13］。CLEAs制备中的一个关键参数是交联剂的浓度，因为它会影响交联剂的活性、操作稳定性和颗粒大小（形貌）。Zerva等［14］在制备交联阿魏酸酯酶聚集体的过程中，当使用300 mmol/L戊二醛作为交联剂时观察到最大酶活回收率为68.8%，随着浓度的增加，酶活回收率开始下降。因此戊二醛浓度应该谨慎选择，过低的浓度会导致酶交联不充分，不溶性聚集体较少，导致操作不稳定的CLEAs释放游离酶进入反应介质；但过高的浓度会导致酶分子的硬化，从而使酶的柔韧性丧失［15］。交联过程中交联时间对酶活影响也较大，交联时间短，交联不足，导致酶活回收率较低，操作稳定性差；较高的交联比有利于更快的交联反应，但交联时间的延长限制了酶的柔韧性，从而造成酶活性的下降。因此，最佳交联时间可能需要在有效交联和酶稳定性两方面做出选择［7］。在Zheng等［16］的实验中发现枯草芽孢杆菌酯酶的酶活回收率随戊二醛浓度的增加而增加，并在采用浓度60 mmol/L戊二醛和3 h交联时间时酶活回收率达到70%左右，随着交联时间的延长，酶活回收率下降。表明过度的交联可能会影响活性位点的可用性，从而降低CLEAs的活性。Dalal等［17］在脂肪酶的交联实验中，当交联时间分别为4、6、8 h时，酶活回收率从100%降低到85%再到50%，脂肪酶CLEAs的热稳定性和重复使用性也随着交联时间的增加不断降低。可见，交联时间的长短极大地影响了CLEAs的制备。

1.3 pH值

pH在固定化酶的过程中起着重要作用，由于pH值的变化，酶会受到排斥力（静电和分散）的影响，当pH接近蛋白质等电点时，静电作用力减小，导致蛋白质聚集沉淀［18］。在用戊二醛进行蛋白质分子交联反应中，主要涉及到高活性表面非质子化的氨基与戊二醛醛基之间的相互作用［8］。Yang等［15］考察了戊二醛作为交联剂、（NH4）2SO4和丙酮分别作为沉淀剂时不同pH值下对酶活回收率的影响。发现在pH值分别为8和5.5时酶活回收率最高，这是由于pH值分别影响着氨基的电荷、戊二醛的活性和聚合，从而影响交联效率。在大多数研究中，CLEAs的制备都是在中性或微碱性pH范围内进行的，这是因为戊二醛在中性pH附近对蛋白质具有较高的反应活性，由于蛋白质中存在多个反应残基和水溶液中戊二醛的分子形式，从而导致了许多不同的反应机制［19］。因此，在考虑戊二醛的反应活性时，还应考虑pH值的选择。

1.4 添加剂

在制备CLEAs时，如果酶浓度较低或酶活回收率较低时，补充合适的添加剂可促进CLEAs的制备，还可以抵抗高浓度交联剂对酶活的影响，这主要是通过提高溶液中蛋白质的浓度对酶起保护作用，防止酶的分解和非特异性吸附，减轻一些不利环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的变性［20］。最常用的添加剂是牛血清蛋白（BSA），Cui等［21］以牛胰脂肪酶为原料，将脂肪酶与BSA共聚合，制备了牛胰脂肪酶CLEAs。添加了BSA的脂肪酶CLEAs在重复使用8次后，保留了75%以上的初始活性，而未添加BSA的脂肪酶CLEAs仅保留了其初始活性的20%。此外，添加BSA的脂肪酶CLEAs具有更高的贮存稳定性和可回收性，可用于不同的工业应用。Torabizadeh等［22］用阳离子辅助法制备耐热淀粉酶CLEAs，α-淀粉酶的聚集和交联是在阳离子富集的非水环境中进行的，在最佳配比下，Ca2+和Na+的加入提高了淀粉酶的活性和操作稳定性。添加表面活性剂或胺等可以显著提高酶活回收率，十二烷基硫酸钠（SDS）作为表面活性剂被添加在脂肪酶CLEAs中，其催化活性提高了两倍以上［23］。综上，补充适当的添加剂是一种生产高活性、高稳定性的CLEAs的有效途径。

2 CLEAs改进策略

近年来，CLEAs的制备方法已经取得了非常大的进展，然而，一些不理想的因素也限制了其进一步的应用。如交联效率低导致酶活的损失；抗压强度差导致其在溶液中再次分解；应用过程中回收率差等情况［7］。因此，后续发展出多种策略对CLEAs技术进行改造。

2.1 载体共固定CLEAs

通常情况下，CLEAs粒子尺寸较小通常在10 μm以下，将其从反应物中重新回收出来比较困难，而且对于一些工业应用来说，CLEAs机械稳定性不高，容易被外界压力破坏［24］。近年来研究出一种新型载体共固定CLEAs的技术，将CLEAs与载体材料结合起来不仅可以使机械强度提高，还表现出了高存储稳定性和热稳定性。Reshmi等［25］尝试将β-葡萄糖苷酶吸附在中孔二氧化硅泡沫（MCF）上，然后用戊二醛对酶进行交联。MCFs中的CLEAs具有较高的酶活回收率和稳定性。且易回收，重复使用10次后仍有85%活性。Park等［26］采用静电纺丝法制得稳定的壳聚糖纳米粒子，然后将蛋清溶菌酶固定在电纺壳聚糖上制备CLEAs，室温下保存80 d后仍有75.4%的活性，连续使用100次后仍有76%的活性，该CLEAs对四种典型致病菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌的抑制率都接近80%，说明固定化电纺壳聚糖溶菌酶CLEAs在抗菌性能方面有很好地应用。由此看来，采用载体和CLEAs结合的方法为固定化酶提供了一种简便低成本的方法，并且具有很高的稳定性和酶活回收率，具有很好的工业应用前景。

2.2 多酶CLEAs

将多种酶固定在同一个基质中，不仅降低了循环过程的成本，而且与单独固定化酶的混合物相比，使不同种类的酶彼此接近，从而使反应系统中不同酶之间的中间产物易于扩散［27］。杨猛等［28］以Corynebacterium酮还原酶KRED30和Bacillus subtilisD-葡萄糖脱氢酶（GHD1）为模式酶，制备了高活力复合CLEAs。在水相体系中复合CLEAs可有效催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）和间氯苯乙酮（CPO）还原合成手性醇，连续催化10次，残余活性仍保留70%以上，表明复合CLEAs一种可行的辅酶再生方法，显示了优良的催化性能和工业应用潜力。Periyasamy等［29］采用木质纤维素生物质来生产生物乙醇，制备了木聚糖酶、纤维素酶和β-1，3-葡聚糖酶的复合酶，其热稳定性和贮存稳定性优于游离酶，复合酶在48 h内水解了84%左右的甘蔗渣（SCB），而游离酶的最大水解率为73%，回收的复合酶在6次循环使用后仍有90%的活性。通过循环使用不仅降低了使用成本，而且相比较于单独固定的酶混合在一起，效果更好。

2.3 磁性CLEAs

磁性交联酶聚集体（Magnetic cross-linked enzyme aggregates，M-CLEAs）技术是一种相对较新的酶固定化方法，主要是将CLEAs附着在氨基功能化磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNP）上［30］，不仅可以改善酶的力学性能，还能够使磁性反应混合物中的固定化酶易于分离和循环利用［8］。Su等［31］制备了MNP酮还原酶和D-葡萄糖脱氢酶共固定CLEAs，发现添加了MNP后的聚集体其长期储存的稳定性明显提高，多批次反应后，M-CLEAs的酶活回收率均高于不添加MNP的酶活回收率，达到60%左右。由于磁性Fe3O4纳米粒子的存在，固定化酶在磁场的作用下，可以方便快速地回收。Sóti等［32］研究了磁性木质纤维素固定化酶同时在糖化、解毒和发酵过程的影响。通过接种液回流和缩短发酵时间，使酶的最终产品价格降低了15%，并且从液体培养基中一步回收了99.5% M-CLEAs，而88%M-CLEAs仍可从高固体含量的发酵液中回收，而且使用固定化酶的成本比游离酶降低了60%左右。综上，与游离酶相比，M-CLEAs对抑制剂、酸性pH和废水不但具有更高的稳定性，而且经磁铁回收后可重复使用，将成为CLEAs一个很有潜力的研究方向。

3 CLEAs在固定化漆酶中的应用

目前合成类染料在纺织印染等工业应用广泛，染料种类繁多、结构复杂且难降解，大部分具有较大毒性会给水体环境及人类健康造成严重危害［33］。漆酶由于催化底物广泛在染料降解应用中具有很好的前景，漆酶CLEAs可以降解多种不同结构的染料，如蒽醌（RB亮蓝）、三苯甲烷（孔雀绿）、偶氮（活性黑5）等［34］。此外，漆酶CLEAs具有较好的环境耐受性及重复利用率，大大节约了使用成本。Cerrenasp. HYB07的漆酶CLEAs与游离漆酶相比，在80 mmol/L NaCl存在情况下对RB亮蓝和孔雀绿有更好的降解效果，2 h内降解率达到90%［15］。Fomes fomentarius和Trametes versicolor的漆酶CLEAs，在4℃储存70 d后，分别保留了初始活性的74%和80%，在重复使用6次和8次以后，仍有50%酶活回收率，对孔雀绿、溴麝香草酚蓝和甲基红的降解率在10 h后达到90%以上［35］。为了得到稳定且易回收的生物催化剂，Kumar和Cabana等［36-37］首次将MNP与CLEAs结合并应用于漆酶固定化，可降解61%-90%的RB亮蓝、活性黑5、孔雀绿，在反复使用10次后仍有70%左右酶活回收率，添加MNP不但提高了酶活回收率，还提高了CLEAs的稳定性，并且更方便回收反复使用。与真菌漆酶相比，细菌漆酶一般在高温和碱性条件下具有更好的耐受性而受到广泛关注。Sinirlioglu等［38］利用Shewanella putrefaciens重组漆酶制备了CLEAs，24 h降解90%以上的孔雀绿，在70℃仍具有活性，在5次循环利用后保留60%的酶活回收率。本课题组近期也利用Bacillus amyloliquefaciens的重组漆酶制备了CLEAs，该固定化酶在60℃下放置6 h仍保留70%的活性，对靛红的降解率达到90%，反复使用6次后仍有50%的酶活回收率。

漆酶CLEAs还被广泛应用于降解内分泌干扰化学物质（EDCs），Cabana等［37］研制了基于漆酶CLEAs的催化装置，可以在较大的浓度范围内降解多种EDCs，对壬基酚、双酚A和三氯生去除率可达到85%以上，该固定化酶反应器具有低成本、操作简单等优点，在环境领域有广泛的应用前景。抗生素作为新兴污染物引起了越来越多的关注，四环素类抗生素如四环素（TC）和土霉素（OTC），是一种广泛存在于废水和天然水体中的广谱抗菌药物［39］。漆酶CLEAs在无氧化还原介质参与的情况下，在12 h内降解超过80%以上的四环素类抗生素，48 h内可完全消除100 μg/mL TC［40］。漆酶由于氧化还原电位的限制，不能直接催化具有高氧化还原电位的底物，为了增加漆酶的氧化能力，可以添加低浓度氧化还原介体，加快反应进程。如添加常见介体2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）后，漆酶CLEAs可完全去除废水中的乙酰氨基酚，对非诺贝特、安定、甲氧苄啶和酮洛芬的去除率达到50%左右［41］。在制备漆酶CLEAs时，通过添加辅助蛋白可较大程度提高酶活回收率。Jiang等［42］发现添加了天然蛋清后的漆酶CLEAs稳定性明显提高，与游离和不添加蛋清相比，在60℃下热稳定性可提高1.8倍，反复使用7次后仍有76%的酶活回收率，30 h后对4-氯苯酚和2，4-二氯苯酚的降解率分别达到83.6%和91.5%。漆酶CLEAs还可以参与脂肪醇氧化反应的循环利用，使1-庚醇在20 h内仅用1 U/mL漆酶CLEAs就达到了55%的转化率，而同一转化率下所需的游离漆酶为10 U/mL［43］。

4 结论和展望

漆酶是一种环境友好型生物催化剂，通过固定化漆酶可有效提高其稳定性和重复利用率。CLEAs是一种较新型的固定化酶技术，具有操作工艺简单、稳定性好、可重复使用、酶不需要完全纯化、制备成本低等优点。该技术在固定化漆酶应用上具有广阔的前景，如在合成染料降解、内分泌干扰物质去除、抗生素转化等方面都有很好的应用效果。目前制备CLEAs一般都是使用真菌漆酶，应用最多的是Trametes versicolor，其具有较高的氧化还原电位，分布广泛和活性较高等特点［44］，但真菌漆酶一般只能在较低温度和酸性条件下发挥作用，而纺织和造纸等工业领域往往存在高温和碱性等环境，限制了真菌漆酶的使用。而细菌漆酶则在高温、碱性、高盐等条件下具有更好的稳定性，今后应加大对细菌漆酶CLEAs的开发和应用［45］。通过一些改进策略如载体共固定CLEAs，使其机械稳定性提高，表现出高稳定储存性及热稳定性；通过多酶CLEAs技术，可以改善反应物的局部浓度，提高回收率；通过M-CLEAs技术，使反应混合物中的酶可以更好地分离和循环利用。然而仍有许多方面需要进一步研究，如CLEAs制备工艺的通用性不强，通常对一种漆酶优化的制备条件可能对另一种酶甚至不同来源的同一类漆酶均不适用，因此一般需要对固定化过程进行优化以得到更好的使用效果。此外，对于交联酶粒径方面的控制，以及对于CLEAs导致漆酶活损失的原因还应进一步的深入探索。由此可见，今后应更多关注制备机理的分析、微观结构的表征调控以使CLEAs技术在生物催化和转化中发挥更大的优势。