60Co-γ辐照对不同胡麻品种种子萌发及幼苗生长的影响

赵东晓，王向誉，孙景诗，董亚茹，施新琴，郭洪恩

（山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002）

胡麻(Linum usitatissimum)即油用亚麻，一年生草本植物，有较强的耐旱、抗寒和耐瘠薄能力。在我国，胡麻主要分布在西北、华北等地区，是北方地区重要的油料作物，也是干旱及半干旱地区的主要经济作物[1]。胡麻籽粒含油量高达36.5%～49.5%，仅次于花生(Arachis hypogaea)，而高于向日 葵 (Helianthus annuus)、 大 豆 (Glycine max))、 大麻(Cannabis sativa)等作物[2]。胡麻油是一种优质的食用油，富含人体所必需的α-亚麻酸、油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸，具有抗癌、预防心脑血管疾病、增强免疫力等医疗和保健功能[3]。同时胡麻油易吸收氧气而迅速干燥，是一种典型的干性油，目前已在工业领域广泛应用[4]。胡麻种皮中木酚素含量丰富，木酚素被认为是一种植物雌激素，其结构与人体雌激素十分相似，具有抗肿瘤生成、抗动脉硬化、预防糖尿病、抑制芳香酶活性、抗病毒、抗真菌等多种功效，在食品、临床医学和化妆品领域应用广泛[5]。此外，胡麻籽粒中富含亚麻胶，是食品、医药、轻纺等行业不可缺少的重要原料之一[6]。胡麻种皮中的果胶质占6%～10%，果胶质是一种优良的粘合剂，可当作食品添加剂、化妆品原粉、医药原料等[7]。

与传统育种相比，辐射诱变育种具有方法简单、安全、突变率高、突变谱宽、后代性状稳定、育种周期短、增强抗逆性等优点[8]，能在较短时间内育成新品种，是作物品种改良的重要途径之一[9]。目前在植物育种中被广泛应用。其中60Co-γ辐照是辐射诱变育种最常用的方法之一[10]。近年来，60Co-γ辐照方法已在诸多花卉、农作物、牧草中有研究和利用。乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)种子经 100 Gy 和 300 Gy60Co-γ射线辐照后在 NaCl胁迫下的萌发率提高[11]。低于 200 Gy60Co-γ辐照剂量可促进木槿(Hibiscus syriacus)种子发芽，低于100 Gy辐照能提高木槿幼苗成活率[12]。杨先泉等认为辐照对马铃薯(Solanum tuberosum)的影响主要是损伤和抑制效应，辐照降低出苗率、推迟出苗期、延长出苗持续期，品种(系)间存在敏感性差异[13]。Flores等[14]通过60Co-γ的诱导突变，获得了抗枯萎病的黄果西番莲(Passiflora caerulea)。60Co-γ可去除水稻(Oryza sativa)、花生的真菌污染[15-16]。60Co-γ射线辐照处理可提高黑麦草(Lolium perenne)分蘖数、株高和鲜质量[17]。张彦芹等[18]用60Co-γ辐射高羊茅(Festuca arundinacea)，在植株形态性状和耐旱(寒)性状上均发生了明显变异，并获得了叶片变小、变细且具有耐旱(寒)特性的高羊茅突变体。研究表明 20～40 Gy60Co-γ辐照剂量可以改善德国鸢尾(Iris germanica)种子萌发率，60～80 Gy可以作为德国鸢尾杂交种子的诱变剂量[19]。用60Co-γ射线处理树兰(Aglaia odorata)蒴果，对树兰再生植株的影响明显，对株高、叶长影响最大，叶片数量次之，叶宽最小[20]。耿兴敏等[21]以不同剂量的60Co-γ射线对7个桂花(Osmanthus fragrans)品种的种子进行辐射处理发现，对桂花种子萌发状况的影响存在显著的品种间差异。60Co-γ辐射在亚麻育种中的应用也有不少报道[22]。但都是针对纤维用亚麻或者是用射线照射花药、愈伤组织等[23-26]。以不同品种胡麻种子为材料进行60Co-γ射线诱变育种的却鲜有报道。胡麻种子含油量高，种皮较厚，对60Co-γ射线有较强的抗性，60Co-γ射线育种往往需要更高的剂量。

本研究以不同剂量60Co-γ射线对9个不同品种胡麻种子进行辐照处理，并进行种子萌发和幼苗生长试验，旨在探索60Co-γ射线辐照对胡麻种子萌发和幼苗生长特性的影响，以期探寻胡麻种子半致死辐照剂量，为胡麻的辐照诱变育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试验的胡麻品种天亚10号、定亚17号、张亚3号、陇亚9号、陇亚10号、陇亚11号、陇亚12号、陇亚13号、陇亚14号共9个品种，种子均于2016年收获，由中国农业科学院麻类研究所提供。种子含水量如表1所列。

表1 9个品种胡麻种子含水量Table 1 Water content of the seeds of nine varieties of oil flax

1.2 试验方法

1.2.1 种子含水量测定

种子含水量采用烘干失重法测定。选取颗粒饱满、大小均一的胡麻种子约10 g，80 ℃烘箱烘至恒重，用万分之一电子天平测定种子烘干前后的干重，每个品种设置3个重复。按照以下公式计算种子含水量。

含水量 = (烘干前种子质量 - 烘干后种子质量)/烘干前种子质量 × 100%。

1.2.2 种子辐照处理

选取颗粒饱满、大小均一的胡麻种子送往山东省辐照中心，进行60Co-γ 射线辐照处理，辐照剂量率为 10 Gy·min-1，辐照剂量分别为 0(CK)、200、600、1 000、1 500、3 000、6 000、9 000、12 000、15 000 Gy 共 10 组。每个品种每个辐照剂量 1 000 粒种子，每个辐照剂量设置3个重复，共辐照3次。

1.2.3 室内发芽试验

将不同辐照处理后的种子用75%乙醇消毒20 min，无菌蒸馏水冲洗5～6次。将消毒后的种子均匀地摆放于已灭菌的种子萌发袋 (180 mm × 125 mm)内，加入 30 mL 1/2 Hoagland 营养液。将种子萌发袋置于萌发架上垂直培养，萌发架置于光照培养箱内，培养条件为25 ℃，光照12 h·d-1，光照强度为450 μmol·(m2·s)-1。每个萌发袋 40 粒种子，每个辐照剂量设置3个重复。共进行3次萌发试验。

1.2.4 发芽和生长指标统计

从种子置床之日开始，每隔24 h观察种子萌发情况并统计发芽种子数(以胚根突出种皮1 mm为标准)，连续统计7 d。在置床后8 d，统计出苗率，以2片子叶完全展开且根长大于1 cm视为出苗，用游标卡尺测定每个萌发袋所有出苗的幼苗株高和根长。并按下列公式统计发芽率、相对出苗率。

发芽率 = (正常萌发的种子数/供试种子数) ×100%；

相对出苗率 = 各辐照处理组出苗数量/对照组出苗数量 × 100%。

1.3 半致死剂量的计算及辐照敏感型的划分

1.3.1 半致死剂量(LD50)的计算方法

种子的出苗率为对照50%时的辐照剂量为半致死剂量。利用以下公式计算胡麻种子的半致死剂量[21]。

式中：x为辐照剂量，y为不同剂量下相对出苗率 ×100，N是样本量，LD50为所求半致死剂量。

1.3.2 相关关系的确定

相关系数反映了不同品种胡麻的相对出苗率与辐照剂量的相关关系。利用相关系数公式来计算相对出苗率与辐照剂量的相关系数(r)。

1.3.3 辐照敏感型的划分

胡麻品种辐照敏感型的划分方法，是以不同辐照剂量处理的各个品种相对出苗率所求出的半致死剂量为依据，并利用以下公式计算相对出苗率和半致死剂量[21]：

根据各品种半致死剂量的平均值(x)和标准差(s)，将半致死剂量的平均值加1个标准差以上的半致死剂量划分为迟钝型；以半致死剂量平均值减1个标准差以下的半致死剂量值划分为敏感型；其余的为中间型。

1.4 数据处理

采用Excel和SPSS 20.0对数据进行统计分析。用单因素试验统计分析方法，对胡麻不同处理的试验数据进行差异显著性检测。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ辐照处理对9个胡麻品种种子萌发状况的影响

各个胡麻品种在种子萌发速度和发芽率方面存在差异(图1)。置床后1 d张亚3号、陇亚10号和陇亚13号的发芽率超过50%，其他6个品种发芽率则低于50%，之后各品种的种子萌发率均随着时间的延长不断提高。陇亚14号发芽率最低，对照组种子萌发率仅有55.5%，其他8个品种发芽率均在90%以上，陇亚13号达100%。

经过60Co-γ辐照，不同胡麻品种的种子萌发速度存在差异(图1)。陇亚9号和陇亚14号2个品种在低于1 000 Gy辐照下，发芽率和发芽速度有所提高，之后随着辐照剂量的提高，种子萌发能力下降，其中陇亚9号在 200 Gy辐照下发芽率达93.3%，陇亚14号经过200 Gy辐照后发芽率达到70%，比对照提高了26%；其他7个品种的发芽率和发芽速度则随着辐照剂量的提高而明显下降。辐照剂量超过12 000 Gy时，胡麻种子虽有萌发，但由于生长点受损严重，代谢活动紊乱，生长停滞，置床8 d仍不能抽出胚根，种子最终丧失活力。

2.2 60Co-γ辐照处理对9个不同胡麻品种出苗率的影响

不同胡麻品种在60Co-γ辐照后出苗率和半致死剂量也有所不同(表2)。除了陇亚9号和陇亚14号外，其他7个品种的出苗率均随辐照剂量增加而降低。适宜的辐照剂量可以不同程度地提高陇亚9号和陇亚14号出苗率，该剂量为200 Gy，陇亚9号在200和600 Gy辐照后相对出苗率高于未辐照组，分别达到103.75% 和101.28%。陇亚14 号在 1 000 Gy及以下辐照后出苗率高于对照组，200 Gy辐照后相对出苗率高达127.25%，显著高于未辐照组(P＜0.05)。6 000 Gy辐照后，9个品种的相对出苗率均急剧下降，除了定亚17号和陇亚13号，其他品种均低于50%。

利用直线回归方程 y = a + bx 和公式 (1)、(2)、(3) 计算出各胡麻品种半致死剂量范围在 5 681～6 668 Gy，半致死剂量由高到低分别为陇亚14号(6 668 Gy)、 陇 亚 13 号 (6 521 Gy)、 定 亚 17 号(6 462 Gy)、天亚 10 号 (6 417 Gy)、陇亚 9 号 (6 399 Gy)、张亚 3 号 (5 869 Gy)、陇亚 11 号 (5 786 Gy)、陇亚 10 号 (5 716 Gy)、陇亚 12 号 (5 681 Gy)。

根据公式(4)计算各品种的相对出苗率与辐照剂量的相关系数，结果表明，9个品种的胡麻出苗率与辐照剂量呈负相关关系，相关系数在-0.96～-0.89，即随着辐照剂量的增加，其相对出苗率下降。

2.3 60Co-γ辐照处理对9个不同胡麻品种幼苗生长的影响

60Co-γ辐照对不同胡麻品种株高和根长的影响不同(图2)。9个胡麻品种中除了张亚3号和陇亚13号的株高和根长随辐照剂量升高而降低，其他7个品种在低剂量辐照处理后，株高和根长与对照相比均有所提高，之后随辐照剂量增加，株高和根长逐渐减小。7个品种的株高和根长在200 Gy辐照剂量下达到最大，并随着剂量的增加而降低，且7个品种能够促进生长的辐照剂量区间有所不同：与未辐照组相比，陇亚12号在200 Gy处理后株高根长增加，大于600 Gy时减小；天亚10号、陇亚9号、陇亚10号、陇亚14号在200和600 Gy辐照后株高根长增加，剂量大于1 000 Gy时低于对照；而定亚17号和陇亚11号在1 000 Gy以下辐照时株高和根长高于对照，在剂量大于1 500 Gy时显著减小。

60Co-γ辐照对胡麻根的影响大于对地上部分的影响。随辐照剂量的增加，根长的降低趋势大于株高的下降趋势。1 500 Gy 辐照后侧根变少；6 000 Gy辐照后胡麻幼苗根的生长受到明显抑制，胚根膨大无毛，变粗变短；9 000 Gy辐照根系生长受到严重的影响，基本不能生长，或者出现根尖褐化，生长点明显受到损伤。大于12 000 Gy时胡麻的子叶和胚根均不能抽出种皮。

图1 不同剂量辐照处理对9个胡麻品种种子发芽速率和发芽率的影响Figure 1 Effect of different doses of radiation on the germination speed and rate of nine varieties of oil flax

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2.4 胡麻品种辐照敏感型的划分

根据公式(5)计算出9个品种胡麻种子的半致死剂量的平均值为 6 169 Gy，标准差为 396 Gy，将半致死剂量大于6 565 Gy的材料划分为迟钝型，小于5 773 Gy划分为敏感型，其余的为中间型。可以看出，9个品种中，陇亚10号和陇亚12号属于辐照敏感型，天亚10号、定亚17号、张亚3号、陇亚9号、陇亚11号、陇亚13号属于中间型，而陇亚14号则为辐照迟钝型(表3)。

由此可见，不同品种胡麻种子的适宜辐照剂量存在差异，可能与胡麻品种种皮厚度、种子的大小、含水率、含油量有关。

表3 9个品种胡麻种子的辐照敏感性Table 3 Radiation sensitivity of the seeds of nine varieties of oil flax

3 讨论

本研究结果表明，60Co-γ射线对胡麻种子具有一定的辐照效应。低剂量辐照促进陇亚9号和陇亚14号萌发，原因是适当剂量的辐照处理会引起种子内部生物自由基或有关酶活性的变化，从而提高了种子的新陈代谢水平，促进种胚组织细胞生长和分裂，提高种子活力[27]，或者低剂量的γ射线辐照可能会增加种子萌发过程中对氧气的吸收量，导致有机或无机过氧自由基的产生，继而打破种子休眠，同时在种子萌发的早期阶段可以活化相关RNA或蛋白质合成，从而提高种子萌发率[28]；而高剂量辐照使种胚组织受损，影响了细胞生长和分裂，延迟了种子萌发进程，使种子活力降低。类似结果在乌拉尔甘草[11]、鸢尾[19]、牧草[29]、野牛草(Buchloe dactyloides)[30]、高羊茅[31]、毛竹(Phyllostachys heterocycla)[32]、 万 寿 菊(Tagetes erecta)[33]、贝壳花(Moluccella laevis)[34]中也有报道。

γ射线辐照可以导致植物在细胞水平上发生多种生化反应，从而引起植株外观形态发生变化[35]。本研究中，低剂量辐照可以促进7个品种幼苗株高和根长的生长，可能是由于低剂量的60Co-γ射线辐照可以提高植物体内的生长素水平，进而刺激植物生长[36]。这与萝卜(Raphanus sativus)[36]、香茅(Cymbopogon martinii)[37]等植物相似。本研究发现，在受到较大剂量辐照后胡麻幼苗根系受到的伤害大于幼芽，在高剂量辐照后胡麻不能成苗多是由根系损伤导致生长停滞造成。较高剂量的辐照会导致胚根肥大无毛，变粗变短，失去发芽能力，称为“肥根”现象[38]。黄永芳等[39]认为这是由于过高剂量的辐照抑制了种胚分生细胞的有丝分裂，细胞分裂受阻，只发生分生细胞液泡化和伸长，胚突破种皮造成萌发假象。胡重怡等[40]在研究辐照对烟草 M1代种子萌发及幼苗生长时也发现60Co-γ射线对烟草(Nicotiana tabacum)幼根的损伤比幼芽大。朱宗文等[41]在研究60Co-γ射线对番茄幼苗生长的影响时也有同样的发现。另外，在本研究中还发现一定剂量的辐照后，侧根的生长首先受到明显抑制，这与李志能等[42]在悬铃木(Platanus hispanica)中的研究结果不同，说明不同植物对60Co-γ射线辐照的响应也不尽相同。高剂量辐照后少数胡麻幼苗植株出现黄化、矮化、叶片畸形、变小、根尖膨大等诱变效应，但是由于试验时间短，尚不能确定引起此现象的原因是辐照后的生理损伤还是可遗传的突变，因此还需要进一步观察后代表型，并进行细胞学鉴定。

γ射线辐照对不同胡麻品种的影响不同。低剂量辐照提高陇亚9号和陇亚14号发芽率和出苗率，而降低了其他7个品种的发芽率和出苗率；适宜剂量的辐照可以促进天亚10号、定亚17号、陇亚9号、陇亚10号、陇亚11号、陇亚12号、陇亚14号幼苗株高和根长的生长，而抑制其他2个品种幼苗的生长。不同胡麻品种的辐照敏感程度也不同，本研究根据胡麻种子对60Co-γ 辐照敏感性的不同，将不同胡麻品种分为辐照敏感型、中间型和迟钝型 3 种类型。已有学者研究了不同品种桂花[21]、 高 羊 茅[31]、 番 茄[39]、 小 麦[43]、 杜鹃(Rhododendron simsii)[44]的辐照效应，认为种子辐照敏感性的差异与种子大小、种皮厚度、含水量和一些小分子物质含量以及遗传背景等各种外部和内部因素有关。

辐射诱变的关键是确定适宜的辐照剂量，适宜的辐照剂量才能获得有效的诱变。在一定范围内增加辐照剂量可以增加突变率、拓宽突变谱，但过高的辐照剂量会降低成活率[45]。一般都以半致死剂量作为辐照育种的适宜辐照剂量[21]。半致死剂量或称临界剂量，多作为衡量辐照效应的一个指标，适宜的辐照剂量是辐照诱变中获得有效辐照效应的重要依据。半致死剂量既是确定辐照敏感性的主要指标，也是辐照育种适宜引变剂量的参考。有研究用辐照后的发芽率计算半致死剂量，结果往往偏大。因为经过辐照处理后许多种子能正常发芽而最终不能成苗，主要原因是真叶不发育或根系无法形成，本研究中高剂量辐照后发芽率和成苗率也有很大差别，所以，用发芽率计算的辐照半致死剂量和大田试验中得到的结果会有较大的差距。李秀芬等[12]和吴问胜等[46]也认为种子萌发率不宜作为辐照敏感性的指标。一般可采用生长量为对照的70%，或采用植株成苗率50%的剂量来确定其半致死剂量[47]。因此，本研究根据辐照后相对成苗率计算不同品种胡麻辐照的半致死剂量，范围为 5 716～6 668 Gy。可见不同胡麻品种的半致死剂量差异较大，实际研究中要根据品种的抗辐照能力来确定辐照的适宜剂量。此外，本研究得到的胡麻半致死剂量较其他物种偏大，可能是由于胡麻作为油料作物，种皮较厚，种子较大，而且胡麻种子富含胡麻油、亚麻胶、果胶等，可能对辐照有一定的屏蔽作用，导致胡麻种子对辐照不敏感。这与同样作为油料作物的油菜(Brassica napus)种子相似[48]。十字花科植物种子含有对辐照有屏障作用的丙烯芥子油，因此对辐射不够敏感[49]。胡麻种子含油量较高，推测胡麻籽油对辐照也有一定的屏蔽作用。此外，种皮的厚度、结构、胶质和水分、酚类化合物及纤维素含量也会对辐照有一定的影响[49]，这也许是胡麻种子抗辐照能力较强的另一原因。

邹德炎[50]提出，茶树(Camellia sinensis)种子的适宜辐照剂量，应当依据其萌动状态、辐照后第1年的茶苗突变频率和两三年内茶树生长表现来确定。本研究仅对辐照后胡麻种子萌发和幼苗生长进行初步研究，是否能产生变异和能否定向选育尚无法得出结论。因此，研究辐照后胡麻整个生命周期的生长表现以及后代胡麻的表型是下一步的研究方向，辐照处理胡麻种子能否得到可遗传的稳定变异还需要进一步探索。

4 结论

根据对60Co-γ辐照敏感性的不同，胡麻种子可分为辐照敏感型，中间型和迟钝型 3 种类型。除陇亚9号和陇亚14号外，其他7个品种种子发芽率与辐照剂量呈负相关关系。较低剂量的辐照可以提高陇亚9号和陇亚14号2个品种种子的发芽率和出苗率，增加天亚10号、定亚17号、陇亚9号、陇亚10号、陇亚11号、陇亚12号和陇亚14号 7个品种的根长和株高。而高剂量辐照降低了9个品种种子发芽率、出苗率及株高、根长。陇亚 14 号半致死剂量为 6 668 Gy，陇亚 13 号为 6 521 Gy， 定 亚 17 号 为 6 462 Gy， 天 亚 10 号 为 6 417 Gy，陇亚 9 号为 6 399 Gy，张亚 3 号为 5 869 Gy，陇亚 11 号为 5 786 Gy，陇亚 10 号为 5 716 Gy，陇亚12号为5 681 Gy。综合萌发率、出苗率、幼苗生长等情况，建议辐照剂量应控制在6 000 Gy左右。