疏血通注射液对兔耳增生性瘢痕MMP-2和ɑ-SMA表达的影响

施建飞 陈晓栋

增生性瘢痕(HS)是以成纤维细胞过度增殖为特征的皮肤纤维增殖性疾病,其特征是由成纤维细胞分泌的细胞外基质过度沉积[1]和基于胶原，如胶原蛋白I和胶原蛋白III的细胞外基质蛋白质的代谢紊乱[2]。最常继发于烧伤后，是消防员烧伤康复的主要后遗症。增生性瘢痕不仅导致外观变化还影响器官和组织功能，给患者生理和心理带来极大痛苦，目前治疗的手段多是在瘢痕形成后才开始干预，防治策略多为抑制成纤维细胞增殖、促其凋亡、调节胶原代谢，治疗方法多样[3]，然而效果不甚理想。

在瘢痕组织中，成纤维细胞发挥重要作用，因此，防治瘢痕形成与发展的重点是抑制成纤维细胞的生物学活性。临床实践中，糖皮质激素，如曲安奈德、复方倍他米松注射液等单独或联合其他药物，如5-FU等进行瘢痕内注射，是治疗增生性瘢痕的常用方法之一[4]。但是这些药物本身的毒副作用及疗效不确定，使之具有局限性。从中药和天然药提取物中筛选抗皮肤瘢痕的功效药物，该方向有较大的研究价值。

疏血通的主要成分水蛭、地龙，抗凝、溶栓，对血小板聚集有一定抑制作用、对血液流变学的改变有作用。静脉滴注疏血通，抑制抗血小板的聚集，改善微循环,提高创面肌层组织血流的供应,改善局部细胞的代谢,增加营养，从而有利于组织的早期修复[5]。疏血通局部注射用于增生性瘢痕的治疗未见相关报道，本实验以兔耳增生性瘢痕模型[6]为研究对象，局部注射疏血通，观察并研究它对增生性瘢痕组织作用的影响，为药物的临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择新西兰白兔9只，由南通大学实验中心供应。雌性5只，雄性4只，体质量2.0～2.5 kg，兔耳完整健康，分笼进行喂养.按照随机数字表法分为3组，每组3只，所有动物一般资料无显著性差异。所有实验按照国际实验动物管理委员会指南进行。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 参照李荟元等[6]模式建立兔耳增生性瘢痕模型，用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)作耳缘静脉麻醉，皮肤消毒，沿长轴避开可见血管，利用角膜环钻作直径1cm圆形创面，创面距离1cm以上，去掉兔耳全层皮肤并用刮勺完全刮除软骨膜，创缘彻底止血，每耳6处，共108个创面，术后创面暴露，待其自行愈合。

1.2.2 药物注射 建模后30 d,待创面上皮化后,将其随机分为3组，空白对照组，曲安奈德组，疏血通组，每组3只。疏血通组和曲安奈德组分别注射疏血通注射液和曲安奈德注射液，空白对照组注射等剂量生理盐水。注药方式参照文献[7]：用微量注射器从创面四周的正常皮肤进针向创面基底部及创面灶内局部注射，注药量为50 μL/创面，3天给药1次，共6次。

1.2.3 瘢痕增生指数测量 给药后20 d，在无菌条件下取材，用螺旋测微仪测算瘢痕厚度及瘢痕四周正常皮肤厚度[8]，瘢痕增生指数=瘢痕厚度/正常皮肤厚度，记录数据。

1.2.4 HE染色 作HE染色时，取出切片在37℃孵育箱中进行回温，将回温好的切片，水中浸泡30～60 s左右。染色前用蒸馏水润湿组织1～2 min，核染液染色5 min左右，水洗3～5 s，分色剂中蘸2下，水冲。桨染液染色2 min，按照梯度脱水，吸干，封片镜检。

1.2.5 VG染色 VG天青石蓝染色液滴染2～3 min，稍水洗， Mayer苏木素染色液滴染2～3 min。稍水洗，酸性乙醇分化液分化1～2 s。流水冲洗10 min。用配制好的改良VG染液滴染1～2 min。急速用水洗一下，即用95%乙醇快速分化脱水,无水乙醇脱水3次，每次5～10 s。二甲苯透明3次，每次1～2 min,中性树胶封片镜检。

1.2.6 qRT-PCR 引物序列:GAPDH上游5’-CGATGGTGAAGGTCGGAGTG-3’，下游5’-ACATGTAGACCATGTAGTGGAGG -3’；MMP2 上游5’-CACTGGTGTTGGGGGAGATT-3’，下游5’-CACGGACCACTTGACCTTCT -3’；ɑ-SMA 上游5’-TGTCAGGAATCCCGTGAAGC-3’，下游5’-CATTGTCACACACAAGGGCG-3’；按试剂盒说明,在反应管中依次加入试剂。GAPDH作为内参 .采用2-△△CT的方法分析增生性瘢痕组织中 mRNA水平。

1.2.7 Western Blot 实验方法参照文献所述[9]，组织称重，加入裂解液，充分匀浆，离心后，取上清,测定蛋白浓度。凝胶电泳后，转膜，封闭，加一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h, 显影。GAPDH作为内参。采用Image J软件对蛋白条带灰度值进行检测。

2 结果

2.1 瘢痕厚度及瘢痕增生指数 兔耳增生性瘢痕模型建立，待创面上皮化，给药后20 d，在无菌条件下取材，测量瘢痕厚度及瘢痕四周正常皮肤厚度，并计算瘢痕增生指数，结果显示：与空白对照组相比，曲安奈德组和疏血通组瘢痕厚度明显降低，瘢痕增生指数降低。 曲安奈德组和疏血通组两组间比较差异无统计学意义(表1)。

2.2 HE染色 我们采取HE染色的方法验证增生性瘢痕组织中成纤维细胞表达情况，结果显示：空白对照组中有较多的成纤维细胞，而曲安奈德组与疏血通组成纤维细胞相对较少(图1)。

2.3 VG染色 我们采取VG染色的方法进一步验证增生性瘢痕组织中胶原纤维表达情况，结果显示：空白对照组胶原纤维排列相对较为密集，曲安奈德组与疏血通组成胶原纤维排列相对较为稀疏(图2)。

表1 各组瘢痕厚度及瘢痕增生指数比较

注：与空白对照组相比，曲安奈德组和疏血通组瘢痕厚度明显降低***P<0.001，与空白对照组相比，曲安奈德组和疏血通组瘢痕增生指数降低**P<0.01

2.4 qRT-PCR检测增生性瘢痕组织中MMP-2和 ɑ-SMA的mRNA水平的变化 我们采取qRT-PCR的方法检测增生性瘢痕组织中MMP-2和 ɑ-SMA mRNA水平表达变化，结果显示：与空白对照组相比，曲安奈德组和疏血通组MMP-2 mRNA表达显著降低(***P<0.001)，ɑ-SMA mRNA表达降低(**P<0.01)。曲安奈德组和疏血通组两组间比较差异无统计学意义(表2、图3)。

2.5 Western blot检测瘢痕组织中MMP-2和ɑ-SMA表达相对灰度值和蛋白表达变化 我们采取Western blot方法检测增生性瘢痕组织中MMP-2和 ɑ-SMA 蛋白表达变化，结果显示：与空白对照组相比，曲安奈德组和疏血通组MMP-2和ɑ-SMA蛋白表达降低(**P<0.01，*P<0.05)。曲安奈德组和疏血通组两组间比较差异无统计学意义(表3、图4)。

表2 2-△△CT方法分析增生性瘢痕组织中mRNA水平

注： 与空白对照组相比，***P<0.001，**P<0.01

表3 Image J分析增生性瘢痕组织中蛋白表达相对灰度值

注：与空白对照组相比，**P<0.01，*P<0.05

1a、1b、1c分别为空白对照组，曲安奈德组，疏血通组，空白对照组中有较多的成纤维细胞，而曲安奈德组与疏血通组成纤维细胞相对较少

图1 给药20 d各组兔耳瘢痕HE染色结果(×400)

2a，2b，2c分别为空白对照组，曲安奈德组，疏血通组，可见空白对照组胶原纤维排列相对较为密集，曲安奈德组与疏血通组成胶原纤维排列相对较为稀疏，(胶原纤维为鲜红色，肌纤维、胞质及红细胞为黄色，细胞核为蓝褐色)

图2 给药 20 d 各组兔耳瘢痕VG染色结果(×400)

图3 增生性瘢痕组织中MMP-2和 ɑ-SMA mRNA水平 3a：MMP-2 mRNA水平 与空白对照组比较***P<0.001，3b：ɑ-SMA mRNA水平 与空白对照组比较，**P<0.01图4 增生性瘢痕组织中MMP-2和 ɑ-SMA蛋白表达变化 与空白对照组相比，**P<0.01；*P<0.05

3 讨论

Retz在1789年描述了皮肤瘢痕，它们的组织学外观是由于成纤维细胞过度增殖，真皮层细胞凋亡受到抑制后的皮肤受损[10]。HS有时会产生瘢痕挛缩，特别是对于关节的瘢痕挛缩，会导致关节功能障碍。有许多治疗增生性瘢痕的方法包括糖皮质激素瘢痕组织内注射、压力疗法、硅胶产品外用、手术切除、激光和冷冻治疗等。其中，曲安奈德或复方倍他米松注射液通过局部注射治疗增生性瘢痕[11]，药物的效果比较明显，但反复多次局部注射对机体影响较大，如:注射时疼痛剧烈;停药后局部发红、水肿、灼热、瘙痒、干燥、脱屑等[12]。根据文献报道，曲安奈德对瘢痕成纤维细胞的生长分化能力和胶原的产生有一定的抑制作用[13]。

据文献报道[14]MMP2的活性在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中显著增加,当MMP2升高时促进瘢痕疙瘩中的成纤维细胞中的迁移活动。ɑ-SMA一直被认为是区别成纤维细胞与转化成肌成纤维细胞的可靠标记，以及组织纤维化水平[15]。在瘢痕形成的病理过程中，成纤维细胞被激活分化成肌成纤维细胞表达过多的a-SMA，并产生大量的ECM如胶原蛋白I和胶原蛋白III[16].a-SMA是一种在血管平滑肌和肌成纤维细胞表达的蛋白质，是增生性瘢痕的特征性标志并通过肌成纤维细胞收缩对发病机制有显著意义[17]。

血管生成对伤口愈合和组织再生是必不可少的，特别是在愈合的增殖阶段。在伤口愈合过程的早期阶段，观察到稳健的新血管形成。人们普遍认为，炎症和伤口愈合延迟与瘢痕形成有关。尽管血管生成对伤口愈合至关重要，但许多研究表明过度的血管生成反应导致瘢痕形成[18]。微血管形成在增生性瘢痕中比在正常营养性瘢痕中更剧烈。疏血通的主要成分是水蛭与地龙，水蛭对凝血酶的产生有一定的抑制作用,是一种功能比较强的凝血酶抑制剂,对微循环的改善和抗凝血功能有明显的作用[19]。静脉滴注疏血通具有对抗血小板的聚集和改善微循环的作用, 提高创面肌层组织血流的供应改善局部细胞的代谢,增加营养,祛腐生肌,从而有利于组织的早期修复[5]。

本实验观察治疗后兔耳增生性瘢痕的外观形态学发现，疏血通组瘢痕的颜色有相对变浅的趋势，厚度也稍有降低。对成纤维细胞和胶原纤维的表达有一定的抑制作用，疏血通局部注射后能降低瘢痕组织内ɑ-SMA和MMP-2的表达，一定程度上抑制瘢痕的形成。

疏血通注射液可能通过降低MMP2和ɑ-SMA的表达，对增生性瘢痕有一定的抑制效果，这为疏血通局部注射治疗增生性瘢痕的临床应用提供了一定的理论依据。