耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因检测及其同源性分析

王 璐，高绪锋，张凤丽，胡燕云，黄 颖，徐元宏

临床上，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KPN)常常引起呼吸道、泌尿道、消化道、血液及其他无菌部位(如腹腔、胸腔、关节等)感染[1]。KPN的分离率呈逐年稳步上升趋势，且耐碳青霉烯KPN(CRKP)的检出率也在逐年上升，至2017年，KPN对亚胺培南和美罗培南的耐药率达到20.9%和24.0%，耐药率上升幅度高达8倍[2]。KPN对碳青霉烯类药物耐药大多是由于其产碳青霉烯酶，尤以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniae carbapenemase，KPC)为主。我院自2018年以来，CRKP的检出率逐渐上升，本研究收集2018年4-6月分离自临床科室的CRKP 40株，进行碳青霉烯酶基因检测及菌株同源性分析，以期进一步了解我院CRKP的耐药性与分子流行病学特征，为有效治疗和预防CRKP感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中任一药物耐药定义为CRKP，所有菌株均为连续分离的非重复菌株，同一病人同一标本只取第1 次分离株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，KPN ATCC1705，KPN ATCC1706，大肠埃希菌ATCC 8739，系安徽医科大学第一附属医院检验科惠赠。KPC、OXA-48、NDM-1阳性对照菌株系中国人解放军总医院检验科惠赠。

1.1.2 主要试剂和仪器 MAC平板、BP平板、MH平板及VITEK 2 Compact型全自动微生物分析仪和革兰阴性菌鉴定药敏卡(GN和GN13)均购自法国梅里埃公司，美罗培南药物敏感性纸片(10 μg)购自英国Oxoid公司，胰酪大豆胨液体培养基(TSB)购自北京三药公司，PCR仪购自美国BIO-RAD公司，电泳仪及凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司，PCR试剂购自日本Takara公司，引物交由生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离培养、鉴定与药敏方法 按照《全国临床检验操作规程》对临床菌株进行分离培养。标本分别接种于血平板和麦康凯，35 ℃培养16～18 h，挑取疑似菌落进行种类鉴定。菌种鉴定及药物敏感性试验采用法国梅里埃VITEK 2 Compact型全自动细菌鉴定药敏仪进行，菌株对常用抗菌药物的敏感性采用梅里埃VITEK 2 Compact GN 13卡进行检测，试验操作及折点判断依据美国临床实验室标准化研究所标准操作规程(CLSI-M100-27)进行。

1.2.2 改良Hodge(MHT)试验 将大肠埃希菌ATCC 25922配置成0.5麦氏浊度的菌悬液，稀释10倍后均匀涂布于MH平板上，在平板中央贴10 μg美罗培南纸片。然后用接种环挑取单个过夜培养的新鲜菌落，以纸片边缘为起点离心方向划线接种，35 ℃孵育16～20 h后观察结果。以KPN ATCC 1705为阳性对照，KPN ATCC1706为阴性对照。若被测菌株线与大肠埃希菌ATCC 25922抑菌圈交汇处出现大肠埃希菌生长增强现象，即为阳性[3-4]。

1.2.3 改良碳青霉烯灭活试验(mCIM试验) 取1 μL过夜培养的CRKP菌落接种于2 mL TSB 肉汤中，涡旋振荡15 s，将10 μg美罗培南纸片浸没于TSB菌液中，35 ℃孵育4 h。待孵育结束时，将美罗培南纸片从TSB菌液中取出，贴于0.5 麦氏浊度大肠埃希菌ATCC25922涂布的MH 琼脂平板上，35 ℃孵育18～24 h。KPN ATCC1705为阳性对照，KPN ATCC1706为阴性对照。根据CLSI M100 27th进行结果判读[4]。

1.2.4 耐药基因检测 采用煮沸法提取待测菌株的基因组DNA作为模板。取无菌水1 mL加入高压灭菌后的EP管中，挑取35 ℃、 16～18 h生长的菌落适量在EP管壁研磨制成菌悬液，然后将菌悬液100 ℃加热30 min，冷却至室温后，高速离心取上清液作为PCR扩增的模板。同时使用多对特异引物序列进行多重PCR扩增，按如下设置扩增条件：预变性94 ℃ 5 min，然后变性94 ℃ 45 s、退火55 ℃ 45 s和延伸72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳观察CRKP菌株是否携带待检的碳青霉烯耐药基因。将部分扩增产物送测序公司进行测序，测序结果在 GenBank 中进行比对分析，以确定扩增产物的种类和型别[5]。引物序列见表1。

表1 碳青酶烯耐药基因引物序列

1.2.5 同源性分析 CRKP菌株35 ℃过夜后，挑取单个纯菌落，将其均匀涂抹于靶板上，放置后滴加1 μL α-腈基-4-羟基肉桂酸基质液，待干燥，将靶板放入 VITEK MS 仪器中，使用科研库进行聚类分析。仪器将细菌蛋白质峰图与数据库里参考图谱比较并进行多种算法计算，给出鉴定结果。可信水平在60.0%～99.9%为可接受结果。然后在系统内进行同种细菌间的聚类分析。

1.3 统计学方法 应用 Excel 软件，对数据进行排序计算，应用 WHONET 5.6软件对药敏试验结果进行统计分析。

2 结果

2.1 CRKP的分布情况 CRKP 40株中分离自 ICU 病房的占55%，急诊科占15%，呼吸内科占10%，普外科一病区和神经内科二病区各占5%，神经内科一病区、肾脏内科及肿瘤内科各占2.5%。标本类型中以呼吸道的标本居多，占80%，其次是尿液、血液及分泌物各占5%，胸水和腹水各占2.5%。

2.2 药敏结果 40株CRKP对厄他培南及环丙沙星耐药率均为100.0%，对亚胺培南耐药率为92.5%，对阿米卡星耐药率为80.0%，对三代头孢菌素类、氨基糖苷类、青霉素类耐药率均超过90.0%(见表2)。

表2 CRKP菌株对常用抗生素耐药情况

2.3 MHT、mCIM 试验及几种常见的碳青霉烯耐药基因检出结果

2.3.1 MHT、mCIM 试验结果 40株 CRKP 中，33株菌 MHT 和 mCIM 试验均为阳性，2株菌(9号和34号)均为阴性，剩下5株菌都是 MHT 试验阳性而 mCIM 试验结果为阴性(见表3)。

2.3.2 几种常见的碳青霉烯耐药基因检出结果 KPC、OXA-48、NDM-1 PCR凝胶电泳结果显示，32株CRKP携带KPC基因，测序后用Gene Bank进行比对，结果显示32株KPC基因型均是 KPC-2型。此次试验未检出OXA-48及 NDM-1基因(见表3)。部分试验结果见图1～2。

表3 MHT、mCIM 试验及几种常见的碳青霉烯耐药基因检出结果

2.4 VITEK MS质谱仪同源性分析 按照相似度为80%～100%为同一型别的分类方法，该40株 CRKP 可分为7个型别，A 型34株，占85%，是主要型别，B、C、D、E、F及G型各1株，各占2.5%(见图3)。

3 讨论

耐碳青霉烯的肠杆菌科往往对多种抗生素耐药严重，治疗极其困难，而成为全球范围的公共卫生问题，近几年又以 CRKP 最为突出[6-7]。研究证明，CRKP 的耐药机制主要是由于携带碳青霉烯酶，以KPC为主，该酶因首次在KPN 中被检出，因此命名为 KPC[8]，是含有丝氨酸残基的 A 类碳青霉烯酶，由265～269个氨基酸组成。携带 KPC 基因的KPN大多数为多重耐药菌，因为 KPC 基因存在于带有耐药性决定因素的大质粒上，其中包括对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类等耐药的质粒[9]。CRKP在医院内广泛传播的因素目前尚未研究清楚，但可能与长期接触急性护理设施、较高的共病程度、长期使用抗生素以及长期使用留置管和中心静脉导管等有关，继而引起感染[10-11]。CRKP 感染的病人，其住院时间延长，多数会住进 ICU 病房进行抢救治疗，且相较于产超广谱β-内酰胺酶或对碳青霉烯敏感的KPN病死率较高[12]。本研究中，CRKP 对多种抗生素的耐药性普遍较高，对头孢菌素类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药率都在90.0%以上，与其他报道[13-15]相似。有研究[16]表明治疗时采用多药联合或选用新的β-内酰胺酶抑制剂组合或许有效。

本次试验中有26株CRKP MHT试验及 mCIM 试验阳性且检出 KPC 基因，4株 MHT 阳性、 mCIM 阴性并携带KPC基因。 KPC 基因检测阳性的菌株 MHT 试验结果均为阳性，这与胡仁静等[17]研究结果相同。有7株菌 MHT 及 mCIM 试验阳性，但未检测到 KPC、OXA-48 及 NDM-1 基因，推测可能携带有其他碳青霉烯类耐药基因，如 VIM、IMP等[18]。还有2株菌 MHT 和 mCIM 试验均为阴性，且未检出待测基因，可能与 MHT 和 mCIM 试验在检测不同类别碳青霉烯类基因时灵敏度不同、菌株携带其他碳青霉烯类耐药基因或者存在外膜蛋白丢失等其他非耐药基因因素有关。本研究中 CRKP 多为 KPC-2 型，这与国内报道[15,19-20]相符，但也有研究[21]认为 CRKP 流行菌株多为IMP-4型，但这需要大量数据的进一步研究。MALDI-TOF MS在过去十年中给微生物学诊断工作流程带来巨变[22]。研究表明，MALDI-TOF MS除了在微生物鉴定方面以外，在流行病学分型和耐药检测方面同样具有巨大的潜力，其分型准确度与脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型大致相当，且具有快速、经济、方便等优点[23-25]。本文中采用MALDI-TOF MS 进行同源性分析，40株 CRKP分为7个类型，其中A 型34株，占85%，B、C、D、E、F 及 G 型各1株，各占2.5%，以A 型为主，主要集中在ICU病房和急诊科，同时存在于神经内科、神经外科及普外科一病区，因此我们认为，本院存在以A型为主的 CRKP 的流行传播。

综上所述，我院 CRKP 耐药程度较高且有流行播散的趋势，因此院感部门应对重点科室加强耐药监测，采取适当措施，严格控制进一步的传播流行。同时后续应当补充其他耐药基因检测及进一步研究是否存在外膜蛋白的丢失及药物泵出等机制，为研究CRKP的传播机制提供思路。