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儿童肺泡灌洗液肺炎支原体检出率及基因型分析

2019-02-19汪小五丁圣刚王林定唐振华朱义朗

蚌埠医学院学报 2019年1期
关键词:洗液条带肺泡

汪小五,丁圣刚,王林定,唐振华,朱义朗,高 勇

社区获得性肺炎中比较常见的病原体就是肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)[1]。肺炎支原体肺炎(MPP)是一种自限性疾病,但是有时会引起各种肺部疾病如支气管炎、脑炎、坏死性肺炎,严重者甚至会导致死亡[2]。MP感染的流行周期为3~4年[1,3]。MPP还没有明确的发病机制,从临床症状分析可能是病原体入侵机体呼吸上皮细胞的纤毛状上皮细胞或者是机体免疫反应的结果[4]。P1基因具有其自然特性即高度保守性,且随着分子生物学技术的发展可根据分离株中P1氨基酸序列之间的差异把其分成两大类型P1-Ⅰ型和P1-Ⅱ型[5]。对MP流行株的基因型进行分析可对其发病机制和临床诊断治疗进行探讨[5]。本实验收集儿童的肺泡灌洗液标本,了解合肥地区儿童MP流行株基因型的现状。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 选取2013年8月至2016年1月安徽医科大学第一附属医院儿科儿童肺泡灌洗液标本136例。本研究通过医学伦理委员会审核同意,研究对象同意并签署知情同意书。-80 ℃保存样本。

1.1.2 材料来源 MP(FH;ATCC15531)标准菌株(美国ATCC产品)为实验室保存。

1.1.3 主要试剂 MP快速培养试剂盒购自珠海迪尔生物工程有限公司;细胞基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化有限公司;DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司。

1.1.4 引物 普通PCR引物[6]为含内切酶BamH Ⅰ酶切位点的上游引物为5′-TTG GAT CCA AGG GGG TGT GGG CGG A-3′;内切酶SalⅠ酶切位点的下游引物为5′-TCG TCG ACG GTG GAG GAG GTG TTT C-3′。BamH Ⅰ酶和SalⅠ酶切位点分别为GGA TCC和GTC GAC。巢式和多重PCR引物参照文献[7]由上海生物工程有限公司合成。巢式PCR-P1基因的重复序列RepMP4序列的外内侧引物分别为ADH2F/ADH2R:5′-GGC AGT GGC AGT CAA CAA ACC ACG TAT-3′/5′-GAA CTT AGC GCC AGC AAC TGC CAT-3′和内侧引物ADH3F/ADH3R:5′- GAA CCG AAG CGG CTT TGA CCG CAT-3′/5′-GTT GAC CAT GCC TGA GAA CAG TAA-3′。P1基因的重复序列RepMP2/3序列的外内侧引物分别为ADH3/MP2/3-R1:5′-CGA GTT TGC TGC TAA CGA GT-3′/5′-AGA TTG ACC TGA GCC TGA AG-3′和内侧引物MP2/3-F2/MP2/3-R2:5′-CAC AAG TGG TTC GCG TTC CT-3′/5′-GGC TGG GTG GAA TGG TCT GT-3′。多重PCR-P1基因重复序列引物为ADH4F:5′-GAC CGC ATC AAC CAC CTT TGC GTT ACG-3′/N1:5′- CCC GGT GGT GGA AGT ATT TT-3′/ 2N2C: 5′-CGA GTT TGC TGC TAA CGA GT-3′/MP2/3-F3: 5′-TCG ACC AAG CCA ACC TCC AG-3′/ R3-1 :5′-TTG GAA TCG GAC CCA CTT CG-3′/R3-2 : 5′- CGA CGT TGT GTT TGT GCC AC-3′ /R3-2V 5′-CGG TAT AGC TAA TTT GGT AC-3′ 。

1.2 MP阳性标本的筛查和基因分型

1.2.1 肺泡灌洗液的收集 行纤维支气管镜术,取液体标本在1 h内处理标本,保存于-80 ℃待实验。

1.2.2 MP(FH;ATCC15531)标准菌株培养 严格按照实验室购买的MP快速培养试剂盒说明书中的步骤操作。

1.2.3 普通PCR法筛查MP阳性标本 cDNA提取:-80 ℃取出136份肺泡灌洗液标本和MP(FH;ATCC15531)标准菌株转阳培养液按细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。普通PCR技术筛查MP阳性标本。

1.2.4 MP阳性标本的基因分型 P1基因的重复序列RepMP4序列和RepMP2/3序列的外侧引物和内侧引物以及试剂盒提取的基因组DNA模板按照巢式PCR扩增体系进行扩增。外侧扩增体系为50 μL总体积:RepMP4序列退火温度为75 ℃ 30 s;RepMP2/3序列退火温度为61 ℃ 30 s。内侧扩增体系为50 μL总体积:RepMP4序列退火温度为73 ℃ 30 s;RepMP2/3序列退火温度为65 ℃ 30 s。多重PCR进行分型扩增体系为50 μL总体积:RepMP4序列退火温度为70 ℃ 30 s,DNA模板为巢式PCR RepMP4序列扩增产物稀释1 000倍;RepMP2/3序列退火温度为70 ℃ 30 s,DNA模板为巢式PCR RepMP4序列扩增产物稀释1 000倍。

1.2.5 MP阳性标本扩增条带确定 1%琼脂糖凝胶电泳验证及基因测序。

2 结果

2.1 MP阳性标本的筛查 普通PCR法对从肺泡灌洗液中提取的基因组DNA中进行扩增,1%琼脂糖凝胶电泳后显示有513 bp目的条带(见图1)。136例标本中检测出52例MP阳性标本,阳性率为38.2%。

2.2 MP阳性标本的基因分型 1%琼脂糖凝胶电泳分析MP阳性标本巢式多重PCR扩增产物发现:RepMP4重复序列扩增出了大约343 bp条带;RepMP2/3重复序列扩增出了大约394 bp 条带(见图2)。FH标准菌株则在RepMP4重复序列扩增出了大约560 bp条带;RepMP2/3重复序列扩增出了大约617 bp 条带(见图3)。基因序列测序匹对后正确。

3 讨论

肺炎是儿童和青少年常见的呼吸道感染引起的一种疾病,往往发病都考虑为细菌或者病毒感染引起,会常常忽略支原体的感染而延误治疗[8]。快速准确的检测方法非常重要。MP检测的金标准是培养法,但是其培养时间长,市场快速培养试剂盒检出率又低[9]。核酸检测方法是近年来比较流行的检测方法,可直接从呼吸道标本中检测出病原体特殊的DNA片段[8]。本实验收集了行纤维支气管镜术儿童肺泡灌洗液标本进行普通PCR扩增检测其感染MP的情况,发现136例疑似感染MP标本中有52例是扩增阳性结果,其感染率为52.8%。该数据可以反映合肥地区儿童在近期感染MP情况。

MP基因型依赖于P1基因的快速循环PCR(Rapid-Cycle PCR)和PCR-限制性长度多态性分析(RFLP)方法[10]。本实验室采用巢式多重PCR技术对52例阳性标本进行了分析:均扩增出了P1-Ⅰ

型的目的条带。对照组扩增出P1-Ⅱ型的目的条带。该数据可以反映合肥地区儿童感染MP流行基因型均为P1-Ⅰ型。

王楠等[5]检测西安地区儿童感染MP流行基因型均为P1-Ⅰ型。KENRI等[7]采用的巢式多重PCR的方法将1995-2005年十年间的MP菌株进行了分型发现P1-Ⅰ型和P1-II型交替存在并发现了变异株。本实验未能发现亚型,可能是由于样本量的局限。

收集来的136份肺泡灌洗液标本中有52份是MP阳性标本,即合肥地区儿童MP的感染率为38.2%,而且全部为P1-Ⅰ型。该调查结果初步说明合肥地区儿童感染MP主要为P1-Ⅰ型。虽然样本量有限,后期还会继续扩大样本量,来补充实验数据的不足,但是该结果对临床治疗还是有一定的指导意义。

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