MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞DLK1表达水平的影响

史啸坤 楚晨

【摘要】目的 DLK1-DIO3印記区间位于人14号染色体、小鼠12号染色体上，在两者的表达中高度保守，其间有三个父本控制的蛋白质编码区域，以及多个母本控制的非编码转录本，还有大量的C/D snoRNA和microRNA。其间有三个差异甲基化区，分别为父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR。先前关于对MEG8-DMR的研究集中于肿瘤方面的较少，因此探究差异甲基化区MEG8-DMR对肿瘤发生的影响以及其调控机制，深入分析印记基因参与肿瘤的发病机理，具有重要的意义。方法 本实验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，先依据脱靶位点少的原则选择sgRNA，构建重组载体并通过脂质体法将其转染入Huh7细胞后检测出重组载体在Huh7细胞系中对MEG8-DMR区域进行了有效的敲除。结果 敲除MEG8-DMR后细胞形态没有发现明显变化，同时发现敲除MEG8-DMR导致上游基因DLK1表达水平的下调。结论 本实验中通过对MEG8-DMR的敲除，导致DLK1表达下调，而DLK1在几种肿瘤包括神经纤维瘤、骨髓增生异常综合征和肝癌患者的血清中呈高表达，且肿瘤的形成是多因素、多基因共同参与的结果，MEG8-DMR上下游区域分布着一系列母系表达非编码转录本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及临近基因在肝细胞性肝癌的发生过程中可能具有表达调控的重要功能。

【关键词】MEG8-DMR;肝细胞性肝癌;CRISPR/Cas9;Huh7细胞;DLK1

【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2019.1..03

【Abstract】Objective The imprinted region of DLK1-DIO3 is located on human chromosome 14 and mouse chromosome 12 and is highly conserved in the expression of both. There are three parental control protein coding regions and multiple maternal controlled non-coding transcripts，and a large number of C/D snoRNAs and microRNAs.There are three regions of differential methylation between the parental methylated IG-DMR and MEG3-DMR， and the maternal methylated MEG8-DMR. Previous a few studies on MEG8-DMR focused on tumors.Therefore，it is of great significance to explore the influence of MEG8-DMR on tumorigenesis and its regulation mechanism and to deeply analyze the pathogenesis of the imprinted genes involved in tumors.Methods In this study， CRISPR/Cas9 gene editing techniques were used to select sgRNAs based on the principle of less off-target sites，construct recombinant vectors and transfect them by liposome method.After incorporation into Huh7 cells， it was detected that the recombinant vector effectively knocked out the MEG8-DMR region in the Huh7 cell line.Results No significant changes in cell morphology were observed after knockout of MEG8-DMR.It was also found that the knockdown of MEG8-DMR resulted in the down-regulation of the expression level of the upstream gene DLK1.Conclusion In this experiment，the knockdown of MEG8-DMR resulted in the down-regulation of DLK1 expression.DLK1 was highly expressed in the serum of several tumors，including neurofibroma， myelodysplastic syndrome and liver cancer， and the tumor formation was multifactorial.As a result of multiple genes co-involved，a series of maternal expressive non-coding transcripts and a large number of miRNAs and C/D snoRNAs are distributed in the upstream and downstream regions of MEG8-DMR.Therefore，MEG8-DMR and its adjacent genes may play an important role in the regulation of hepatocellular carcinoma.

【Key words】MEG8-DMR;Hepatocellular carcinoma;CRISPR/Cas9;Huh7 cells;DLK1

基因组印记是经典的表观遗传学现象，常表现为父源或母源一方的等位基因表达，而另一方的等位基因沉默。之前的研究表明，在这样的印记基因簇中，总分布着一些差异甲基化区，即父本和母本具有不同甲基化状态的区域，且这些差异甲基化区对印记基因的调控有重要的作用[1]。

DLK1-DIO3印记区间位于人14号染色体、小鼠12号染色体上，在两者的表达中高度保守，其间有三个父本控制的蛋白质编码区域，以及多个母本控制的非编码转录本，还有大量的C/D snoRNA和microRNA。其间有三个差异甲基化区，分别为父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR[2]。

之前的研究表明，在MEG8-DMR的上游和下游分别定点整合和插入AAV腺病毒载体和Sleeping Beauty 睡美人转座子会促进肝癌的发生[3-4]，DLK1-DIO3印记区间中的DLK1、RTL1、MEG3以及microRNA也与肝癌的发生密切相关[5]。因此，探究差异甲基化区MEG8-DMR对肿瘤发生的影响以及其调控机制，深入分析印记基因参与肿瘤的发病机理，无疑具有重要的意义。

CRISPR/Cas9系统是目前基因组编辑领域最受欢迎的新方法。CRISPR/Cas9来源于简单的细菌免疫系统，经过人为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑[6]。CRISPR/Cas9系统已经成功应用于植物细菌酵母鱼类以及哺乳动物细胞，也是目前最高效的基因组编辑系统。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人肝癌Huh7细胞系由本实验室保存;CRISPR/Cas9质粒骨架载体为本实验室改造后的pX458载体;质粒提取试剂盒购自Axygen公司;转染试剂LipofectamineTM 2000 Reagent购自Invitrogen公司;DMEM培养基购自Gibco公司;进口胎牛血清购自Hyclone公司;青链霉素购自Hyclone公司;嘌呤霉素购自Sigma公司;RNAiso Plus、SYBR?Green PCR Master Mix、PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒购自TaKaRa公司;MTT粉末购自北京索莱宝科技有限公司;DMSO购自Sigma公司。

1.2 重组载体的构建以及sgRNA的设计

1.2.1 sgRNA的设计

在网站http：//crispr.dbcls.jp/中输入欲敲除的片段，根据网站给出的结果，依据脱靶位点少的原则，选择sgRNA-F和sgRNA-R，即红色三角形所示位置，从而对MEG8-DMR进行敲除。

1.2.2 构建重组载体及重组载体的转染

在本实验原有的pX458质粒的基础上，首先分别用限制性核酸内切酶Bbs1与Bsa1对其进行切割，再将sgRNA-F和sgRNA-R连入酶切位点，通过脂质体法，使用Lipo2000，利用细胞膜的电性与Lipo2000相互吸引，进而将重组载体传染入人肝癌Huh7细胞。

1.3 目的克隆的筛选

1.3.1 药物筛选

转染24 h～48 h后，鉴于载体本身携带的Puro筛选标签，加入含有嘌呤霉素的培养液，Huh7药筛浓度为2.5 ug/mL。药筛三天后，有限稀释法重新铺于96孔板中，对所获得单个克隆进行继续培养。

1.3.2 PCR检测

利用酚氯仿法，提取单克隆扩大培养后的细胞的基因组DNA，并对其进行PCR检测，对显示有目的条带的实验组进行琼脂糖凝胶电泳回收，然后进行测序，进一步分析其敲除情况，敲除鑒定引物。

1.4 检测Huh7细胞中DLK1表达水平变化

1.4.1 DLK1表达水平检测

通过Trizol法提取细胞总RNA，并将其反转录为cDNA，通过实时定量PCR检测DLK1基因在mRNA水平表达的变化。

2 结 果

2.1 重组载体成功转入目的细胞

根据绿色荧光蛋白的表达，可以看出重组载体成功转染入人肝癌Huh7细胞。

2.2 单克隆筛选鉴定

通过测序比对基因组敲除情况，对野生型细胞、E5号克隆、B7号克隆进行基因组PCR鉴定，野生型条带大小为1528 bp。电泳显示E5号克隆在约350 bp处可见敲除带。

测序比对显示，重组载体在上游靶位点附近和下游靶位点外行使对MEG8-DMR敲除效应，成功敲除1190 bp，两敲除位点10 bp内存在一定的碱基修复差异。E5号克隆确定为本研究实验组目的克隆细胞株。

2.3 细胞形态比对

将野生型细胞和E5号克隆进行细胞形态比较，细胞形态没有发现明显变化。

2.4 实时定量分析DLK1的表达变化

实时定量PCR检测野生型Huh7细胞和E5号克隆DLK1表达水平变化，发现E5号克隆mRNA的表达与野生型细胞相比明显较低。

3 结 论

（1）重组载体可在Huh7细胞系中对MEG8-DMR区域进行有效敲除。（2）敲除MEG8-DMR后细胞形态没有发现明显变化。（3）敲除MEG8-DMR导致上游基因DLK1表达水平的下调。

4 讨 论

本实验中通过对MEG8-DMR的敲除，导致DLK1表达下调，而DLK1在几种肿瘤包括神经纤维瘤、骨髓增生异常综合征和肝癌患者的血清中呈高表达[7]，且肿瘤的形成是多因素、多基因共同参与的结果， MEG8-DMR上下游区域分布着一系列母系表达非编码转录本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及临近基因在肝细胞性肝癌的发生过程中可能具有表达调控的功能，有待于进一步进行研究。

参考文献

[1] Barlow D P.Genomic Imprinting：A Mammalian Epigenetic Discovery Model[J].Annual Review of Genetics，2011，45（1）：379-403.

[2] Court F，Tayama C，Romanelli V，et al.Genome-wide parent-of-origin DNA methylation analysis reveals the intricacies of human imprinting and suggests a germline methylation-independent mechanism of establishment.[J].Genome Res.2014，24（4）：554-569.

[3] Donsante A，Miller D G，Li Y，et al.AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma[J].Science，2007，317（5837）：477.

[4] Dupuy A J，Rogers L M，Kim J，et al.A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice.[J].Cancer Research，2009，69（20）：8150-8156.

[5] Lin S P，Youngson N，Takada S，et al.Asymmetric regulation of imprinting on the maternal and paternal chromosomes at the Dlk1-Gtl2 imprinted cluster on mouse chromosome 12[J].Nature Genetics，2003，35（1）：97-102.

[6] 鄭武，谷峰.CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J].遗传，2015（10）：1003-1010.

[7] Jelinic P，Shaw P.Loss of imprinting and cancer[J].Journal of Pathology，2007，211（3）：261.

本文编辑：刘欣悦