脱落乳牙牙髓干细胞的生物学特性及应用

向进琼

福建师范大学 生命科学学院，福建省发育与神经生物学重点实验室，福建 福州350108

干细胞被定义为具有自我更新和多向分化能力的克隆细胞，负责损伤后正常组织的更新、愈合和再生[1]。长期以来，干细胞一直吸引着科学家的注意，科学家们对干细胞进行了大量的研究，基于干细胞的组织工程也是一种很有前途的方法[2-3]。根据干细胞所在发育阶段的不同，干细胞被分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（adult stem cell，ASC）。虽然与ESC 相比，来源于成体组织的ASC 分化潜能更小，但这些细胞伦理问题较少，因此人们对源自成体组织的干细胞的研究越来越感兴趣。这些成体干细胞现已从各种组织中分离出来，如骨髓、大脑、脂肪、皮肤、神经和牙齿组织等[2]。与从其他组织中获取干细胞相比，牙源性干细胞的获取及储存既简单又方便，已成为研究热点。来自恒牙髓组织、乳牙髓组织和多生牙髓组织的干细胞，其特异性表面标记物和分化潜能各不相同[4]。据报道，脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from hu⁃man exfoliated deciduous teeth，SHED）在多能性和增殖能力方面似乎是效果最好的细胞[5]。

2003年，Miura[6]等首次分离出SHED，发现与牙髓干细胞（DPSC）和骨髓间充质干细胞（BMMSC）相比，SHED具有更高的增殖率和群体倍增值。此外，SHED是从脱落乳牙的残留牙髓中分离出来的，因此无须伦理考虑就可以轻易获得。乳牙向恒牙的过渡是一个非常独特和动态的过程，乳牙的牙髓在出生前就已存在，一直维持到恒牙萌出前，在这个时期，这些干细胞尚未受到遗传或环境因素累积效应的严重影响[7]。SHED也可以在体外和体内分化为成骨细胞、肝细胞、肌细胞、成牙本质细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及皮肤和神经细胞等[6,8-9]。由此可见，SHED具有多种优势，有广阔的应用前景。

1 脱落乳牙牙髓干细胞

1.1 脱落乳牙牙髓干细胞的特征

SHED表现出多种间充质干细胞特性，例如具有典型的成纤维细胞样形态学特征、克隆性、细胞表面抗原表达、细胞增殖能力和多向分化潜能[6]。表型分析显示SHED表达多种间充质标记物，如CD105、CD90、CD146、CD166、CD117、CD105、CD73、CD71、CD44、CD29、CD10和SSEA-4，但不表达CD34、CD197、CD184、CD133、CD106、CD63、CD49e、CD45、CD31、CD7和HLA-DR[6,10-15]。这些结果证明SHED非造血多能干细胞，因为它对造血干细胞标记物CD34表达呈阴性。此外，与DPSC 相比，SHED高表达CD117和CD105，说明SHED更不成熟，且应该具有更好的分化潜能[10]。与DPSC和BMMSC 相比，SHED生长稳定，具有更高的增殖活性，SHED表达更多与细胞增殖和细胞外基质相关途径的基因，例如成纤维细胞生长因子和肿瘤生长因子β[16-18]。

除了具有间充质干细胞的特性，SHED还显示出与BMMSC 类似的强大的免疫调节功能。与BMMSC 相比，SHED在上调Treg和Th17细胞比例方面表现出更显著的效果[19]。在体外，SHED显著抑制Th17 活性，还能有效逆转MRL/lpr 小鼠中的系统性红斑狼疮相关病症[19]。Dai[20]等研究表明，SHED减少了鼻腔炎症，并纠正了变应性鼻炎小鼠模型中的CD4+T细胞免疫失衡，通过诱导Treg细胞的扩增来抑制T 淋巴细胞的增殖并增加Th1/Th2的比例。这些结果表明SHED具有良好的免疫调节能力。

1.2 脱落乳牙牙髓干细胞的多能性

1.2.1 成骨分化 成骨诱导分化后，SHED会表达多种骨标记物，如核心结合因子、碱性磷酸酶、细胞外基质磷酸糖蛋白、骨涎蛋白、骨钙蛋白和成骨细胞标志物Osterix 等[6-7,19-21]。SHED是一种潜在的成骨细胞来源，其成骨分化潜能大于DPSC，但与BMMSC 相比较低[22]。近年来，已发现多种物质能够影响SHED的成骨分化能力。Liu[23]等以硼酸镁和硼酸锌作为诱导剂培养SHED，21 d后发现其成骨细胞分化明显，分化细胞钙矿物大量沉积，并表达多种骨相关基因，如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Runx2、骨钙素、骨桥素、血管内皮生长因子和血管生成素1。证实硼酸镁和硼酸锌是成骨细胞分化的重要诱导因子，这些二价金属离子和B离子可以从支架中释放到培养基中，促进细胞的成骨分化。当在成骨诱导培养基中加入白细胞介素6后，SHED碱性磷酸酶的表达显著上调，矿物沉积也明显增多，与磷酸盐代谢相关的基因也发生了显著变化。说明白细胞介素6 能提高SHED的矿化能力，诱导骨向分化[24]。在含CoCl2的成骨诱导培养基中培养的SHED，其成骨相关基因的表达则会被抑制，碱性磷酸酶活性和钙沉积均呈剂量性降低，说明CoCl2抑制了SHED的成骨分化[25]。由于其成骨分化潜能，SHED成为骨再生工程研究中重要的细胞来源。

1.2.2 成脂分化 已有研究表明，SHED具有向脂肪细胞分化的能力。用脂肪诱导混合物培养SHED可以使其向脂肪细胞分化，并使PPAR-γ和脂蛋白脂肪酶（2种脂肪细胞特异性标记物）的表达上调，油红O 染色结果也证实了SHED的成脂分化[6,26-28]。与DPSC 相比，SHED的成脂分化能力更高。然而，与BMMSC 相比，SHED脂肪形成分化明显降低，表现为脂质特异性油红O 阳性细胞数量减少以及PPARγ2和脂蛋白脂肪酶的表达减少[19]。相反的是，Pivoriuūnas[29]等在一项评估分化的研究中发现SHED具有强烈的成骨分化能力，但没有脂肪形成潜力。

1.2.3 成软骨分化 利用含有ITS、抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸、地塞米松、胎牛血清、TGF-β、BMP-6、青霉素和链霉素成分的诱导混合物，可以使SHED在体外发育成软骨细胞[8]。Chen[30]等的研究也证明，SHED在包含地塞米松、胰岛素、维生素C、TGF-β3和成纤维细胞生长因子的成软骨分化培养基中培养2周可以分化为软骨样细胞。此外，将SHED与β-TCP 支架混合植入裸鼠背部皮下，SHED表现出克隆形成能力和软骨向分化。Koyama[31]等发现，在用BMP-2 处理的SHED和DPSC的微团培养物中均出现软骨细胞结节，但DPSC 中软骨形成标志物（Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和Sox9）的水平显著低于SHED。

1.2.4 成牙分化 Miura[6]等的研究证明SHED在体内和体外都能够分化为成牙本质样细胞。但Gronthos[32]等报道，它还不能再生如DPSC 中所见的牙髓-牙本质复合体。另外，SHED表达BMP 受体，在牙片/支架中培养的SHED中阻断BMP-2 信号通路会抑制成牙细胞分化标志物表达，表明牙本质衍生的BMP-2 是诱导SHED成牙本质细胞分化所必需的[33]。Sakai[34]等将SHED植入牙片/支架材料皮下植入小鼠背部32 d后，牙片髓腔向心形成牙髓样组织，包括牙本质小管和前牙本质。这些组织中牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1 等成牙本质分化标志物表达呈阳性，表明SHED具有分化成功能齐全的成牙本质细胞的能力，这些成牙本质细胞能够在体内沉积类似于牙本质的矿化结构。

1.2.5 成神经分化 大量研究表明，SHED在非神经诱导条件下会表达神经标志物，包括巢蛋白、β-3 微管蛋白、谷氨酸脱羧酶、神经元特异性核蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白和2，3-环核苷酸-3-磷酸二酯酶，这可能是由于牙髓起源于神经嵴[6,35]。Nourbakhsh[36]等将神经诱导剂bFGF 加入培养基中培养SHED，5 d后发现细胞逐渐失去间充质外观，表现出更多的神经样细胞外观，包括神经元样生长，进一步添加SHH/FGF8 可使细胞具有细长和精细的轴突或树突样结构。Su[37]等研究证实，SHED在神经诱导培养条件下，不仅表达早期神经标记物巢蛋白，同时也表达晚期标记物神经元特异性烯醇化酶和神经胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白及2，3-环核苷酸-3-磷酸二酯酶。此外，SHED在三维壳聚糖导管和动态培养系统条件下，神经向分化能力增强，特别是胶质纤维酸性蛋白和2，3-环核苷酸-3-磷酸二酯酶的基因表达分别增加了28倍和53倍[37]。这些结果表明，在离体培养条件下，SHED可分化为功能性神经胶质细胞。用神经营养素脑源性神经营养因子、神经营养素3和胶质细胞源性神经营养因子处理SHED，2周后其形态发生变化，并表达β-3 微管蛋白、GATA 结合蛋白3、原肌球蛋白受体激酶B，说明SHED也可以分化为螺旋神经节样神经元细胞[15]。

1.2.6 成肝细胞分化在添加了肝细胞生长因子和抑瘤素M的无血清培养基中，SHED的形态从成纤维细胞样向卵圆肝细胞样细胞转变。在分化和成熟28 d后，细胞表达与肝细胞相关的标志物白蛋白、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1、肝细胞核因子4α和氨基甲酰磷酸合成酶1[38]。该结果表明SHED具有向肝细胞分化的潜力。Ishkitiev[39]检测了硫化氢对肝细胞分化的影响，发现在暴露于硫化氢的测试组中，肝细胞相关标记物比在对照组中表达更多，尿素和糖原的产生也有所增加。随后，Su[40]等发现在含有甘草和当归提取物的培养基中培养的SHED在甲胎蛋白和白蛋白的表达上呈阳性，证实甘草、当归等中草药可诱导SHED向肝细胞分化。

2 脱落乳牙牙髓干细胞的应用

2.1 骨再生

许多体内研究报道了SHED在人工创造的颅盖缺损中的骨再生的适用性。de Mandonca[41]等发现SHED和胶原膜在颅骨骨缺损中诱导新骨形成，并在大鼠中形成板层骨。SHED与HA/TCP 支架移植能够诱导免疫缺陷小鼠颅骨骨缺损关键部位的骨再生，再生组织含有大量人类骨骼结构和骨髓样成分[42]。在Nakajima[43]的研究中，PLGA膜与SHED的移植也诱导了颅骨缺损中新骨的形成，而且SHED移植与hDPSC和hBMSC 移植产生的新骨量大致相同。然而，在Behnia[44]等进行的研究中，SHED与胶原支架移植的部位和仅仅用胶原支架移植的对照组相比，缺损下颌骨中骨再生没有明显差别，在缺损的舌侧和底部再生的骨组织都是致密的。在骨质疏松症小鼠模型中，静脉注射SHED能够增加骨密度并恢复骨小梁结构，与对照组相比，注射SHED的实验组中表达更高水平的成骨细胞特异性基因Runx2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白[45]。Lee[46]等把SHED细胞培养膜片植入腭突，体外培养后发现表达骨特异性成骨标记物Osterix、骨钙素和骨桥蛋白，证明SHED细胞培养膜片具有矿化潜能。这些研究结果均表明SHED是一种理想的骨组织工程的来源。

2.2 牙髓修复

将SHED与可注射支架移植到人前磨牙根管中，体外培养后可表达成牙本质细胞分化的标记基因[47]。另外，将此根管移植到免疫缺陷小鼠皮下，发现在体内的全长根管中产生功能性牙髓。与对照人牙髓相比，使用可注射支架与SHED产生的牙髓组织呈现相似的细胞性和血管形成[47]。这些研究证实SHED具有在体内生成牙髓样组织的能力，表明其在牙髓组织工程中的潜在应用。

2.3 神经再生

SHED具有显著的神经再生活性，可促进脊髓损伤后的功能恢复。Sakai[11]等将DPSC和SHED移植到脊髓损伤大鼠模型中，移植的DPSC 或SHED明显提高了后肢运动功能的恢复，并且移植的SHED抑制了神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的凋亡，从而在损伤的中心周围区域中保留了神经丝和髓鞘。SHED在体内进行神经源性分化的潜力，为利用这些细胞作为替代模型治疗不同的神经相关疾病提供了可能。

2.4 疾病治疗

通过脾脏将SHED移植到CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠体内，发现SHED明显恢复了肝功能障碍，并使受体肝脏产生抗纤维化和抗炎作用，SHED直接转化为肝细胞而不发生细胞融合[48]。Yokoyama[49]的研究证明，将来源于SHED的肝样细胞移植到CCl4诱导的肝硬化大鼠中，肝硬化大鼠肝脏再生，该病症明显恢复。因此，使用SHED来治疗肝疾病也可能是一个有效的选择。Rao[50]等研究表明，SHED对Goto-Kakizaki 大鼠中二型糖尿病有改善作用。在尾静脉注射SHED后8周，SHED显著逆转了糖尿病诱导的G-6-Pase、Pck1和PK的增加和糖尿病诱导的GSK3β、GLUT2和PFKL的减少，胰岛和肝脏的损伤也得到改善[50]。将来源于SHED的细胞外囊泡经鼻腔给药帕金森疾病模型小鼠后，发现此细胞外囊泡能有效逆转步态障碍，使SN和纹状体TH表达正常化，延缓疾病的进展，减轻帕金森患者的残疾[51]。

3 结语

SHED代表了不成熟的干细胞群，是一种易获得、低侵袭性的间充质干细胞，可以很容易地在体外分离、培养和扩增，并分化为多种细胞。SHED长期冷冻保存后仍可保持未分化和稳定性，也不影响其生物学和免疫学特性。SHED的这些特性使其成为组织工程和干细胞治疗的最有价值的来源。基于干细胞的牙齿再生显示出潜在的临床应用。随着科学技术的飞速发展，牙齿干细胞的研究将为组织工程和再生医学开辟更广阔的应用前景。