PKM2和Notch1在结直肠癌中的研究进展

王 佳，杜文龙，郭渊先，尹兰宁

(兰州大学第二医院普外六科，中国甘肃兰州 730000)

结直肠癌，又称为大肠癌，是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率已上升至世界恶性肿瘤的第3位，严重威胁着人类的身体健康[1]。目前，全世界结直肠癌患者已超过1 000 000人，并且每年有将近500 000人死于该病[2]。近几十年来，中国结直肠癌发病率不断攀升，这可能与人们生活方式的改变、寿命的延长以及结直肠癌的筛查系统不完善有关[3～4]。由于结直肠癌起病常隐匿，早期无明显的临床表现，所以多数患者确诊时已发展至中晚期。其中，50%～60%的患者因发生远处转移[5]，继而失去手术机会，然而对放化疗的抵抗，致使其总体预后欠佳。因此，积极研究结直肠癌的发病及远处转移机制，对于早期诊断及治疗结直肠癌尤为重要。但结直肠癌的发生、发展是一个复杂过程，涉及多基因、多步骤，具体机制目前尚不明确，要了解结直肠癌发生、发展的分子机制，确立防治靶点，寻求新的干预策略以提高对结直肠癌的防治任重而道远。大量的实验数据表明，M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2，PKM2)、Notch1 信号通路对于结直肠癌的发生、发展及远处转移起着重要作用[6～9]，但两者之间是否有相互作用，目前尚不明确。本文就PKM2、Notch1信号通路在结直肠癌中的研究进展予以综述。

1 PKM2与结直肠癌的关系

1.1 PKM2简介

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是糖酵解过程中的一个关键酶，其作用主要是将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，并释放大量的ATP。丙酮酸激酶有4种同工酶(PKL、PKR、PKM1和PKM2)，分别由两种基因(L和M)编码，其中L基因编码PKL及PKR，M基因编码PKM1及PKM2型同工酶。各同工酶分别在特定的组织中表达。PKM2主要表达于胚胎细胞、成体干细胞及增生活跃的组织细胞，然而随着胚胎的发育，PKM2逐渐被其他几种同工酶所替代，但在肿瘤发生过程中 PKM2的表达再次上升，并取代原有同工酶类型[10]。PKM2有单体、二聚体、四聚体3种形式，具有丙酮酸激酶和蛋白激酶两种活性，不仅在糖酵解中发挥作用，而且在细胞核中起蛋白激酶或激活转录因子的作用[11]。其中，以二聚体形式存在的PKM2几乎在所有肿瘤组织都有表达，由于其与磷酸化丙酮酸亲和力较低，易导致磷酸烯醇类物质的堆积，从而利于肿瘤细胞进行有氧糖酵解，故又称为肿瘤型PKM2[12]。

1.2 PKM2与肿瘤代谢

代谢异常是肿瘤细胞的一个共有特点，其中有氧糖酵解增加是肿瘤细胞发生的最常见的代谢异常。所谓有氧糖酵解，是指即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞也倾向于利用糖酵解供能，表现为葡萄糖消耗和乳酸生成同时增加，此过程又称为Warburg效应[13]。肿瘤细胞之所以选择如此低效的供能方式，主要是由于该方式不但可以提供能量，而且大量的中间产物有助于满足肿瘤细胞的快速增殖[14]。此外，乳酸生成的增加一方面有利于肿瘤细胞逃避免疫监测，另一方面可酸化肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的远处转移[15]。PKM2作为糖酵解的关键酶，在维持肿瘤细胞代谢平衡中起重要作用，其通过在高活性的四聚体与低活性的二聚体之间转换，决定葡萄糖是分解为乳酸并产生能量，还是导致糖酵解中间代谢产物积累，促进肿瘤增殖[16]。自噬相关蛋白Atg7(autophagyrelated protein 7)是自噬小体的关键组成部分，可通过阻断PKM2与上游激酶成纤维细胞生长因子受体 1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)的结合，抑制PKM2活性，从而抑制Warburg效应[17]。

1.3 PKM2与肿瘤细胞核内转录

PKM2可进入细胞核参与调控基因表达。在低氧刺激下，PKM2与低氧诱导因子1α(hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α)转录因子相互作用，反式调节丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)、葡萄糖转运蛋白 1(glucose transporter-1，GLUT1)、乳酸脱氢酶 A(lactate dehydrogenase A，LDHA)和PKM2自身的表达，促进肿瘤细胞代谢[18]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的激活，可诱导磷酸化PKM2通过转位进入细胞核，继而激活βcatenin 靶基因 c-Myc 的表达，促进肿瘤增殖[19～20]。PKM2还介导癌细胞在转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)激活时的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而抑制E-cadherin转录[21]。此外，PKM2可作为蛋白激酶，磷酸化组蛋白H3，调控基因表达[22]。由上可知，细胞核内的PKM2也可促进肿瘤发生及增殖。

1.4 PKM2促进肿瘤细胞外泌体分泌

肿瘤细胞通过释放大量含有外泌体、微囊泡或微粒子以及凋亡体的外囊泡来与周围微环境进行物质交换和信息交流，这些物质在促进肿瘤生长和进展方面起着关键作用[23～24]。外泌体中所包含的脂质如胆固醇、甘油二酯、磷脂、鞘脂等，以及一些具有生物活性的脂质分子如前列腺素等[25]，不仅参与维持外泌体的形态，还可作为信号分子参与调节生物学过程，如免疫监视、炎症及肿瘤发育等[26～28]。外泌体可通过将 Notch配体转移到其他内皮细胞，并使其与细胞膜融合，从而抑制Notch信号通路[29]。外泌体也可通过传递其表面携带的Wnt蛋白来调节靶细胞β-catenin依赖性基因表达[30]。此外，近期研究指出，外泌体中所包含的miR-638在结直肠癌中显著下降，是影响结肠癌预后的因素[31]。

突触相关蛋白23(synaptosome-associated protein 23，SNAP23)在肿瘤细胞中可作为PKM2的底物，控制分泌颗粒或者含有外泌体的多泡体的对接以及释放。在肿瘤细胞外泌体分泌过程中，低活性的二聚体PKM2磷酸化后不仅将肿瘤细胞的代谢从氧化磷酸化转化为有氧糖酵解，而且通过直接磷酸化SNAP23促进肿瘤细胞外泌体的分泌[32]。外泌体的释放需要高水平的有氧糖酵解，因此，在肿瘤细胞中，二聚体形式的PKM2对外泌体的释放有关键作用[32]。

1.5 PKM2与lncRNAs

研究发现，超过98%的人类基因组序列没有编码蛋白质的能力，这些不能编码蛋白质的RNAs统称为非编码 RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)[33]。其中长度超过200 nt的ncRNAs，又称为长链非编码 RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)，是ncRNAs家族的重要成员[34]。越来越多的研究表明，lncRNAs在包括结直肠癌在内的人类恶性肿瘤的发生发展中起着关键作用[35～37]。已经报道显示，多种 lncRNA 成员(包括 LINC00152、UCA1、CCAL 和PVT1)在结直肠癌中异常表达，并调节其发生和进展[38～41]。FEZF1-AS1是一种最新发现的在结直肠癌中过度表达的lncRNA，可抑制结直肠癌细胞凋亡[42～43]。PKM2作为结直肠中STAT3信号通路的调节器，是FEZF1-AS1下游的关键靶标。FEZF1-AS1的过表达，不但可以增加细胞质中PKM2的表达，促进有氧糖酵解，诱发结直肠癌，还可以提高细胞核中PKM2的活性，激活STAT3，促进结直肠癌的发展[44]。

1.6 PKM2可用于结直肠癌的辅助诊断

结直肠癌细胞的坏死以及转移，可致使其中所含的肿瘤型PKM2被释放进入血液系统，同时也可经粪便排出[45]。因此，检测血清、粪便中肿瘤型PKM2的含量有助于结直肠癌的辅助诊断。近年来的研究显示，肿瘤型PKM2的检测对胃肠道肿瘤的诊断灵敏度高于传统的肿瘤标志物CEA、CA199和 CA724[46～48]。一项荟萃分析数据表明，粪便肿瘤型PKM2水平的检测对结直肠癌诊断的特异度为84.0%，灵敏度为80.0%;而血清肿瘤型PKM2水平的检测对结直肠癌诊断的特异度为76.0%，灵敏度为66.0%[49]。因此，肿瘤型PKM2对结直肠癌的早期诊断具有明显的辅助作用，而粪便中肿瘤型PKM2的检测，因其具有非侵入性、方便简单的优点，可作为结直肠癌筛查的常规检查。

1.7 PKM2与结直肠癌的治疗

目前，结直肠癌的治疗仍然是以手术切除为主，其次辅以化疗及放疗[50]，但由于2/3的患者在术后会出现复发或远处转移[51]，且多数患者在就诊时已发展至晚期[52]，被迫需要进行化放疗，而化放疗常常因为耐药及抗辐射的发生而失败，因此结直肠癌的治疗效果及预后均很差。多项研究表明，抑制PKM2的表达，可提高结直肠癌的化疗效果。例如:PKM2的抑制，可导致5-FU(5-fluorouracil)在结直肠癌细胞内的排出减慢，提升治疗效果[53];抑制核PKM2功能，或阻断PKM2/STAT3通路，可以提高结直肠癌细胞对吉非替尼的敏感性[54]。在肺癌模型中，通过shRNA(short hairpin RNA)抑制PKM2的表达，可明显提高顺铂和多西他赛对肺癌细胞的杀伤力[55～56]。此外，PKM2与酪氨酸激酶受体EGFR相互作用可促进抗辐射，靶向核内PKM2与EGFR复合物，可能提升放疗敏感性[57]。鉴于PKM2与恶性肿瘤的密切关系，以及其对化放疗治疗效果的影响，寻找以PKM2为靶点的抗肿瘤药物，可为结直肠癌的治疗提供新的思路。

2 Notch1与结直肠癌的关系

2.1 Notch信号通路简介

Notch信号通路广泛存在于脊椎和无脊椎动物体内，是一条维持细胞功能正常运行的信号转导通路，对促进胚胎及成年个体的发育和维持内环境稳定至关重要。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和转录因子CSL三部分组成。Notch受体及配体均为跨膜蛋白质。Notch配体又称为DSL蛋白，分别为DLL l、3和4及Jagged l和 2，共5种。CSL是一种DNA结合蛋白质，由3种转录因子 CBF-1、Suppressor of Hairless和 Lag-l组成，能识别并结合特定的DNA序列。哺乳动物有4种Notch受体，即Notch l～4。Notch受体的结构包括胞外域、膜域和胞内域三部分，其中胞内域的转录后修饰可调节Notch活性。大量研究表明Notch1在结直肠癌中过表达，对结直肠癌的发生、发展起促进作用，是结直肠癌潜在的致癌基因[58～59]。

2.2 Notch1的活性形式NICD1

邻近细胞的配体对信号接收细胞的Notch受体施加的应力对于Notch信号的激活至关重要，并诱导Notch受体发生3次蛋白质水解裂解事件，致使其胞内域NICD(Notch intracellular domain)片段释放[60]。释放的NICD继而进入细胞核，与共转录因子 RBPJ/CSL、Mastermind-like(MAML)、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP结合，诱导靶基因转录编码HES和HEY等转录因子，这些转录因子通过促进其下游靶基因表达，进而促进细胞增殖，抑制细胞分化[61～63]。由于在结直肠癌中Notch1高表达，而Notch1在Notch信号通路激活过程中起主导作用，故其活性形式NICD1在结直肠癌中的作用显得尤为重要[58，64]。

2.3 Notch1与自噬

自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，可以逐渐吞噬细胞内容物，如受损的蛋白质或细胞器，然后与溶酶体融合形成自噬体，降解蛋白质或细胞器，这一过程为细胞提供了自我更新所需的营养和物质[65]。LC3(autophagy marker light chain 3)是自噬体的一部分，自噬可以通过P62介导的NICD1与LC3的结合，促进Notch1的降解[66]。NICD1的自噬降解在细胞核开始，在细胞质中完成。用氯喹抑制自噬，不仅会增加核内NICD的积累，而且可提高其转录活性。因此，调控自噬活性可能对Notch1相关疾病(如结直肠癌等)的治疗有重要意义[66]。

2.4 Notch1与miRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一组内源性、非编码RNAs，长度为18～25个核苷酸[67]。研究表明，miRNAs在几乎所有人类肿瘤中都发生了表达改变，其功能失调可改变多种细胞活动，在肿瘤发生、发展及侵袭中发挥重要作用[68～69]。miRNA-744可靶向作用于Notch1，进而抑制结直肠癌的增殖和侵袭[70]。miRNA-139-5p可靶向作用于Notchl及其下游的两个肿瘤耐药相关基因MRP-l和BCL-2，并抑制它们的表达，从而增强结直肠癌细胞对5-FU的化疗效果[71]。在绒毛膜癌中，miRNA-34a可通过下调Notch信号通路中Notchl和Jaggedl的表达而抑制细胞的增殖和侵袭能力[72]，但其在结直肠癌中是否具有相似的作用，目前尚不清楚。此外，Notch1可以通过对miR-29的早期作用启动CD4 T细胞向T辅助Ⅰ型分化，进而调节人体免疫功能[73]。

2.5 Notch1与上皮间质转化

上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞受到相应刺激，失去固有的极性以及细胞间的连接能力，从而获得较高的迁移、侵袭及抗凋亡能力等间充质特征，是上皮源性的恶性肿瘤细胞获得迁移以及侵袭能力的重要生物学过程，在肿瘤远处转移过程中发挥重要的作用[74～75]。在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中，Notch1过表达可以调节下游信号AKT，进而促进EMT，增强肿瘤侵袭性，因此寻找靶向药物直接作用于Notch1/AKT途径，可有效预防结直肠癌远处转移[76]。

2.6 Notch1与结直肠癌治疗

放疗是结直肠癌Ⅱ、Ⅲ期患者术后及晚期患者进一步治疗的主要措施之一，然而将近一半的手术患者在放疗后仍会出现复发和转移[77]。虽然术前放化疗有助于改善结直肠癌局部症状及病理反应，但结直肠癌中Notch1基因拷贝数的增加及肿瘤干细胞的存在，可对常规放化疗产生抵抗，影响治疗效果，导致预后欠佳[78～79]。DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)是细胞毒性最强的损伤之一，对于大多数癌细胞来说，放疗会导致DSBs和相应的增殖抑制[80]。研究显示，通过DAPT处理或si-Notch1转染抑制Notch1/Hes1信号通路，可以促进DNA损伤和抑制DSBs修复，从而增强结直肠癌细胞的放疗敏感性[81]。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的活性成分，可通过下调Notch1信号通路，抑制结直肠癌细胞增殖，同时可以增强患者对放疗的敏感性及减轻化疗的副作用[82～83]。传统中药片仔癀可通过抑制Notch1通路抑制结直肠癌干细胞的增殖，诱导其凋亡和分化[84]。金雀异黄酮可通过Notch1/NF-κB/slug/E-cadherin途径逆转EMT，诱导结肠癌细胞凋亡[85]。以上研究表明，Notch1在结直肠癌治疗中具有重要作用，这为提高结直肠癌患者放化疗效果提供了潜在的治疗靶点。

3 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt信号通路是在物种进化过程中形成的高度保守的信号通路，主要由Wnt蛋白、跨膜受体卷曲蛋白、松散蛋白、APC复合物、β-catenin、胞质蛋白质和核内转录因子等组成。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt通路，在人类器官系统发育过程中起着重要作用，其功能失调会导致结直肠癌等多种肿瘤的发生[86～87]。

3.1 PKM2与Wnt/β-catenin信号通路

肿瘤细胞分泌的PKM2可通过多种方式调节β-catenin靶基因的表达。比如:EGFR的激活可诱导PKM2磷酸化，PKM2磷酸化后转位进入细胞核，进而激活 β-catenin 靶基因的表达[19～20]。PKM2也可以通过激活 PI3K/Akt，进而诱导 Wnt/βcatenin信号转录，促进结肠癌细胞迁移[88]。此外，PKM2还可以通过外泌体携带的Wnt蛋白调节β-catenin靶基因的表达[30]。

3.2 Notch1与Wnt/β-catenin信号通路

Notch和Wnt信号通路的串扰，可以促进结直肠癌的发生、发展及远处转移[89～91]。在大多数结肠癌标本中，Notch1和β-catenin共表达，且两者在结肠癌细胞中的分布位置相似[92]。目前，对于Notch1和β-catenin之间的相互关联仍存在一定的异议。有研究认为，在结直肠癌中Wnt位于Notch1信号通路上游，β-catenin/TCF通过直接调节Jagged1表达继而激活Notch1[90]，而Notch1可负向调控活性β-catenin水平[93]。也有研究认为，在结直肠癌中Notch1位于Wnt信号通路上游，可通过表观遗传修饰抑制Wnt/β-catenin靶基因的表达[94]，也可通过激活Wnt信号通路发挥致癌作用[92]。

4 小结

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居恶性肿瘤的第3位。细胞代谢和信号通路异常都是恶性肿瘤的特质性改变，与肿瘤的发生、发展及远处转移密切相关。从前文的文献整理可知，PKM2与Notch1都可通过细胞代谢和信号通路参与自噬调节肿瘤细胞的活动，都可促进EMT，增强肿瘤侵袭性，影响肿瘤的转移和复发。PKM2与Notch1在结直肠癌等多种恶性肿瘤中有明显的高表达，且PKM2和Notch1又都与Wnt/β-catenin信号通路之间存在一定的关系，都对结直肠癌等肿瘤的放化疗具有一定的影响。因此，我们推测PKM2和Notch1之间可能存在关联，寻找可以同时抑制二者表达的药物，或联合使用抑制各自表达的药物可能会明显提高结直肠癌的治疗效果。本文通过对PKM2和Notch1在结直肠癌中的研究进展进行综述，了解PKM2和Notch1在结直肠癌发生、发展及放化疗中的作用，为结直肠癌的靶向治疗及耐药性方面的研究提供了一个新的思路。