纳豆激酶分离纯化和酶活性测定的研究进展

法 芸, 张金玲, 赵海杰, 刘会洲*

(1. 中国科学院大学, 北京 100049; 2. 中国科学院青岛生物能源与过程研究所,山东 青岛 266101; 3. 潍坊海关, 山东 潍坊 261041)

纳豆激酶(NK)是新一代极富纤溶活性、安全、经济的溶栓剂,相对分子质量远小于链激酶(SK)、尿激酶(UK)以及重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)这些常用的溶栓药,具有强烈的纤溶活性和多元化的溶栓机制[1]。虽然对甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)、尿激酶原(proUK)等新型溶血栓药物正在开发中,但这些药物均在不同程度上存在一些缺陷,如毒性强、副作用大、半衰期较短、来源紧缺、价格昂贵等[2]。而NK生产成本相对较低,无毒副作用,可由细菌发酵生产,具有很好的市场前景和临床使用价值[3,4]。NK于1980年首次由日本的医学博士须见洋行[5]在纳豆中提取和发现,因其高效的溶栓效果受到人们的普遍关注。2015年,纳豆健康功效再迎来官方认可。纳豆激酶作为功效成分获得国家食品药品监督总局(CFDA)的批准,并对纳豆胶囊保健食品中的纳豆激酶含量、纳豆芽孢杆菌含量做出了明确规定,并在批复文件上附上检测标准[6]。这种在日本、美国等发达国家风靡20余年的心脑血管预防产品,开始得到国人的青睐。近年来,对纳豆激酶在制备工艺[7]、生理生化[8]、药理药效[9]、溶栓机理[10,11]和基因表达[12]等方面的研究获得了长足发展。本文主要对纳豆激酶分离纯化和酶活性测定技术的研究进行综述。

1 纳豆激酶的分离纯化

基因改造技术和发酵工艺优化大大提高了NK的生产,NK高效的分离纯化技术便成为下一步的挑战。目前,NK的分离纯化工艺多采用传统的蛋白质纯化方法,如有机溶剂沉淀、盐析、亲和层析等方法。也有一些新的分离技术和方法,如疏水离子交换法、磁性微球吸附法、膨胀床法、三相分割(TPP)法等。

1.1 有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀法多用于NK粗产品的预分离。Wei等[13]通过菌株筛选、发酵、分离和成胶囊工艺报道了一种纳豆激酶功能食品的制备。对发酵后的鹰嘴豆进行多次水提后利用乙醇沉淀NK,得到活性为(4 000.58±192.98) FU/g的NK粗样品。杨志兴等[14]用生理盐水对Bacillus Subtilis HW-12分泌的溶栓酶进行提取,再用乙醇分级沉淀,然后用柱层析法进一步纯化。

1.2 柱层析法

柱层析分离纯化是分离蛋白质最常用的方法。多数研究者对原料液经过过滤、离心和盐析后,将得到的样品再进行柱层析分离纯化。柱层析分离的方式采用凝胶分子排阻、离子交换、亲和分离或多种方式结合。

Fujita等[15]将NK发酵液盐析离心后,将得到的粗酶上清液分别经疏水色谱柱(butyl-toyopearl)、阳离子交换色谱柱(CM-toyopearl)和凝胶分子排阻色谱柱(Sephadex G-50)分离后得到电泳级NK。闫家麒等[16]和Liu等[17]先将粗酶上清液经过分子排阻色谱柱分离后,前者又经过不同型号的分子排阻色谱柱纯化,后者采用离子交换得到NK。Peng等[18]将硫酸铵溶液盐析后的样品先用阳离子交换和疏水性色谱柱分离后,再用凝胶分子排阻色谱柱过滤得到活性为1.3×105U/L的NK。Wang等[19]和Wang等[20]将硫酸铵溶液盐析后的样品分别经过凝胶分子排阻色谱柱(Sephadex G-75)和(Sephacryl S-100)得到NK,其回收率分别为43.2%和12%。Dubey等[21]和Lin等[22]分别将硫酸铵盐析后的样品经离子交换(DEAE Cellulose和CM-Sepharose)和凝胶分子排阻色谱柱(Sephadex G-75和Sephadex G-50)分离纯化得到NK样品。Li等[23]利用一种His-bond Ni+亲和树脂纯化得到活性为6×105U/L的His-tagged NK。Deepak等[24]将含有NK的B.subtilis发酵液经丙酮沉淀后,用离子交换柱分离得到电泳级NK。然后将NK固定在聚羟基丁酸酯(PHB)纳米颗粒上使NK活性和稳定性增强了20%。

1.3 磁性微球吸附法

磁性微球吸附是20世纪70年代发展起来的一种生物分离技术。微球内核带有磁性,外壳修饰多种功能基可与目标物结合。在外加磁场作用下,结合有目标物的磁性微球可定向移动,达到快速分离的目的。Yang等[25]利用修饰了对氨基苯甲脒的磁性微球来快速分离NK。纯化效率和酶活性回收率分别达到8.7%和85%。

1.4 膨胀床法

膨胀床法是20世纪90年代发展起来的一种新型生物分离技术。根据静电吸附作用,将带有相反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上,许多研究[26]表明膨胀床吸附适合从不透明的原料中分离蛋白质,具有快速分离的优点。Hu等[27]从枯草杆菌发酵液中将粗酶溶液在pH低于其等电点的条件下,采用Streamline SP和Streamline SPXL离子交换柱,直接吸附NK,然后进行清洗解析,整个分离过程缩短为8～10 h。另外Lu等[28]利用一种新型混合模式的膨胀床从发酵液里捕集NK。优化的pH和离子浓度提高了填料的吸附能力,得到的纯化效率达到12.3%。

1.5 反相胶束萃取法

Liu等[29]等首次报道了利用二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠/异辛烷反相胶束分离NK,分离过程包括两步。第一步用50 mmol/L的二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠/异辛烷与解冻的发酵液混合摇晃,混合体积比为1∶1,并在室温条件下调至pH 6.5,离心后得到明显分离的两相。第二步提取:包含蛋白质的胶束相与缓冲溶液(20 mmol/L磷酸缓冲液、0.2 mol/L KCl溶液、15%(体积分数)异丙醇溶液)混合,混合体积比为1∶1。混合物离心后达到明显的相分离。利用反相胶束得到了高达80%回收率的产品。

1.6 三相分割法

Garg等[30]等利用三相分割技术来纯化NK,利用硫酸铵和叔丁醇从原液中沉淀NK。沉淀的蛋白质在下层水相和上层有机相间形成界面。他们优化了温度、pH、硫酸铵和叔丁醇的浓度,仅用一步三相分割得到5.6倍的纯化效率和129.5%的酶回收率。

如上所述,盐析、有机溶剂分级分离等方法广泛用于粗分级分离,这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白质溶液。如果有些蛋白质提取液体积较大,又不适于用沉淀和盐析法浓缩,可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法。传统间歇式的柱层析分离方法用于NK的进一步纯化。一般规模较小,工艺繁琐,分辨率较高。磁性微球法、扩展床法、反相胶束法、三相分割法等方法是基于传统方法的在分离材料和工艺上的改进,分离步骤少,相对成本低,具有快速分离的特点。但选择性和特异性有待提高,规模化生产尚有局限性。现有的分离纯化研究和质量控制中,主要通过NK的酶活性测定进行实验优化和评价。

2 酶活性测定

纳豆激酶是一种相对分子质量为27.8 kDa左右的丝氨酸蛋白酶,因此可以用测定蛋白质的方法检测其浓度。目前蛋白含量测定的方法主要有染料法、双缩脲(Biuret)法、酚试剂(Lowry)法等,但这些方法受共存蛋白质的干扰严重。人们通常用酶的活力测定进行NK定量,尚没有完全规范标准的测定方法[31]。现有的方法包括:纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清平板法、酶联免疫法、纤维蛋白降解法、酪蛋白-Flion-酚法、甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)法等。

2.1 纤维蛋白平板法

纤维蛋白平板法根据Asturp方法改进[32],是目前国家卫生部测定尿激酶及蚓激酶等溶栓酶活力的标准方法。主要原理是以琼脂糖作为相应的骨架,加入相应浓度的凝血酶和纤维蛋白原,二者相互作用,从而在琼脂糖平板上形成人工血栓。NK能将人纤维蛋白降解为可溶性的纤维蛋白片段,因此便会有溶解圈出现,利用游标卡尺测量溶解圈的直径,得到溶解圈的面积,从而可以计算出酶活力。该方法直观简便,可同时测定多个样品。但通过表观的溶解圈面积大小定量纤溶活性,检测误差大,灵敏度低。此外该方法受时间和温度及产品纯度影响较大,另因纤维蛋白源和凝血酶价格高导致检测成本难以降低[33]。

2.2 纤维蛋白块溶解时间法

纤维蛋白块溶解时间法[34]简称CLT法,纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶等溶血栓物质都采用此法测定酶活。该方法的原理是NK和纤维蛋白原反应,有气泡上升到液面,测定其溶解时间。尿激酶或纤溶酶作为标准品,以NK浓度的对数值和纤维蛋白溶解时间作图计算酶活。此方法的优点是分辨率高,测定时间短,更适合于粗酶的活性测定。但该法需要精确判断反应时间,所以不太适合灵敏度要求较高的样品活性测定,难以测量多个样品。

2.3 四肽底物法

四肽底物法[35]是根据枯草杆菌蛋白酶E的酶活测定方法改进。纳豆激酶与枯草芽孢杆菌蛋白酶E有高达99.5%的同源性,二者的催化中心和结合中心相同,只有两个氨基酸不同。因此有人采用四肽底物法测定纳豆激酶的活性。其原理是在四肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-硝基苯胺(pNA)溶液中加入酶液,于37 ℃水浴孵育1 min,测定单位时间内410 nm处光吸收的变化。酶活力单位的定义为1 min内水解该四肽底物生成1 μL硝基苯胺的NK量为1 U。四肽底物法简便、灵敏度高,可迅速测定酶的活性。缺点为四肽底物法测得的蛋白酶活性并不能完全表示其溶纤维活性。

2.4 血清平板法

血清平板法[36]是根据如下原理测定酶活的:纤维蛋白形成初始,在655 nm处的吸光度最大,随着NK的加入,使纤维蛋白溶解,吸光度逐渐下降。吸光度的减少同NK的浓度呈线性关系。其优点是操作简便、快捷,在4 h内可对酶活性进行测定。样品消耗少,成本低,可信度高,可同时检测多个样品,但受人工血栓的质量影响较大。

2.5 酶联免疫法

酶联免疫法[37]是利用NK有特异性的单克隆抗体与纳豆激酶发生特异结合,然后同连有标志酶的多克隆抗体结合,形成一种类似三明治的结构,通过对标志酶-过氧化物酶的反应测定NK的活性。该法具有极高的特异性,灵敏度高达0.1 μg/L,抗干扰性及特异性强。但该方法在测定过程中需要升高温度,易使NK的活性降低。另外操作成本高,难度大,实际应用受到限制。

2.6 纤维蛋白降解法

纤维蛋白降解法测定NK活性[38]的步骤是将纤维蛋白原溶液与Tris-HCl(pH 7～8)混合,于37 ℃孵育,加入凝血酶,配制成为纤维蛋白底物溶液。将纤维蛋白底物溶液与含有NK的肉汤混合,于37 ℃孵育60 min。加入三氯乙酸(TCA)溶液停止反应。作为对照,在37 ℃孵育60 min后,将含有NK的培养液和TCA溶液加入纤维蛋白底物溶液中。样品离心后取上清,测量其在275 nm处的吸光度。一个单位的NK活性被定义为在1 min内使0.01吸光度增加的酶量。

2.7 酪蛋白-Folin-酚法

酪蛋白-Folin-酚法[39]根据蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸,在碱性条件下,酪氨酸与Folin试剂反应生成蓝色物质,于680 nm处比色测定光吸收值,计算酶活力。此方法简单易行,可同时测多个样品,成本低,但需严格控制酶解时间。

2.8 TAME法

TAME法[40,41]以TAME为底物,于574 nm处测定蓝色复合物的吸收度,依照公式TAME(U/mL)=(甲醇微克分子数×样品稀释倍数)/(样品量(mL)×时间(min))计算样品的TAME值。该方法快速、操作简便、灵敏度高、精密度好、重复性好。熊迎新等[40]对TAME法和纤维蛋白平板法进行了比较研究。结果表明TAME法灵敏度高,操作简便,适合作为常规分析检测手段;而纤维蛋白平板法专属性高,但操作繁琐,灵敏度等不及TAME法。

NK酶活性的几种测定方法中,科学家们使用最多的是纤维蛋白平板法,中国、日本、印度、韩国和加拿大的科学家都使用这种方法。很多中国、印度和日本的科学家也在使用纤维蛋白降解法。酶联免疫吸附法有日本科学家在使用。NK测定方法虽然很多,但没有完全规范统一的标准。上述各活性检测方法的局限性常导致相关研究结果之间存在差异,难以进行比对。

3 展望

强劲的市场需求导致NK生产企业数量猛增。2018年5月18日,在由中国保健协会科技发展部[42]指导的“道清源518心脑血管日中日论坛暨纳豆激酶团体标准研讨会”上,中日专家们共同研讨了心脑血管疾病防治工作的新成果和NK产品在国内的发展问题,并启动了“中国纳豆激酶行业团体标准”的制定。这是中国纳豆激酶行业的首个相关标准,宣告中国纳豆激酶全产业即将进入标准化时代。然而,NK作为新产品,国内生产技术工艺尚处于初级阶段。我国开发高纯NK产品则刚刚起步,仅限于纳豆保健品的生产。获得高纯度、高产率的NK产品已势在必行。因此提高NK分离纯化方法的选择性、特异性和高效性将是未来的发展方向。在其生产优化和分离提纯的研究中,不同菌种、不同发酵工艺所得相对分子质量等理化性质也有差别,使得其准确测定和分离较困难。实际应用中,酶活性的测定有时不能直接反映NK的真实产量。这些都限制了其作为溶栓剂的规模生产和开发应用。

基于核酸适配体的识别技术有望成为NK测定和高效分离纯化的发展方向。由于核酸适配体(Aptamer, APT)是一类具有稳定二级结构的DNA片段。具有精准的特异性、高亲和力、便于化学修饰,且易于进行大量低成本的可重复性合成。无机离子、有机分子、蛋白质乃至细胞等均可能存在与其对应的高特异性亲和配体[43]。核酸适配体还可作为一种有效的分子识别工具用于蛋白质的高灵敏分析[44],基于适配体的IgE蛋白质[45]、丙型肝炎病毒聚合酶[46]、胰蛋白酶[47]分析已有报道。这些方法灵敏度高,特异性强。而NK具有特定的空间结构和氢键的供体和受体[48,49],适配体可嵌入到NK表面的特定区域,形成相互作用和特定的空间构型,这种特异性的分子识别能力使NK在复杂体系下能被准确灵敏地捕获,从而实现高效分离。

虽然基于核酸适配体的蛋白质分离分析取得了很大发展,但仍存在一些问题。由于筛选出的适配体数目有限,一些目标物并不容易得到,所以可利用核酸适配体亲和作用分析分离的目标物还不够丰富。另外,蛋白质和适配体的作用相对复杂,对于蛋白质目标物的洗脱往往比较困难,能否找到合适的洗脱溶液还有待于进一步研究。进一步发展适配体有效的固定化方法,提高制备的效率,减低制备成本及不同检测技术的结合,将更有利于核酸适配体在分离分析中的应用及充分发挥其独特优势。