鲜切生菜加工过程对5种农药残留的影响

李凯龙,郭利桃2,*,项 伟,徐文泱,周兴旺,王亮亮,陈同强

(1.湖南省食品质量监督检验研究院,湖南长沙 410111; 2.中国农业科学院麻类研究所,湖南长沙 410205)

鲜切生菜是以新鲜生菜(叶用莴苣)为原料,经切丝、清洗、包装等加工过程,再经冷藏运输进入配送中心、超市冷柜、快餐食品企业等的即食生菜制品。鲜切生菜因其不需要加热处理就可以直接食用,保留了天然的营养特性和蔬菜口感,所以在餐饮环节中的消费有了显著性的增长[1-2]。但生菜大多是在大棚中密集种植,为了减少病虫害对生菜的危害,需要经常使用杀虫剂和杀菌剂,随之而来的就是农药残留的风险。

表1 生菜中常用农药的理化性质、施用剂量及最大残留限量Table 1 Physicochemical properties,dose rates of application and MRL of pesticides

植物源农产品农药残留风险不仅存在于植物种植环节,还存在于其商品加工过程,所以有必要研究植物源农产品在不同加工阶段的农药残留水平。而将加工因子引入膳食暴露量评估,能够更真实的反映食品安全现状,对保障食品安全具有重要意义。每个国家对每种杀虫剂和杀菌剂在每种商品中的残留剂量都有明确规定[3-4]。国内外很多研究都表明不同蔬菜加工过程能减少农药残留水平,而不同加工方式和不同清洗剂对减少农药残留水平的作用有所不同[5-7]。张亚琼等[8]探讨了不同清洗剂对叶类蔬菜在模拟体系中污染的5 种农药残留的洗脱效果及对蔬菜中维生素C的破坏,结果表明,2%食盐水和2% NaHCO3水溶液对农药残留的洗脱效果优于清水,且对蔬菜中维生素C的破坏率小,可作为日常洗涤叶类蔬菜的有效方法。陈志强等[9]研究发现普通家庭清洗和烹饪均能减少毒死蜱在蔬菜中的残留量,而不同清洗方式对农药去除效果相差不大,烹饪过程中样品质量变化可能是导致农药残留差异的主要原因。陈国峰等[10]的研究发现黄瓜中的农药残留量随着冷藏时间的延长越来越低,不同清洗方式(清水和清洁剂)对农药降解的差异与农药在水中的溶解度相关,而在烹饪处理过程中,烹饪所产生的温度为农药降解的关键因素。

生物可给性是评估农药残留膳食暴露对人体健康风险的重要因子[11]。目前评估农药残留对人体健康风险大多是以农产品中残留量的分布以及人体对农产品的摄入量为指标,但未考虑到影响人体健康的只有溶解到消化液中的部分农药。运用体外模拟方法从生物可给性(bioaccessibility,即污染物在胃肠消化过程中从基质如土壤、食物等释放到胃肠液中的量与总量的比值,即基质中污染物被人体吸收的相对量)方面评估果蔬中的农药残留对人体的健康风险已成为当前研究的热点[12]。

本实验首次在田间直接喷施定量的虫酰肼、吡虫啉、氯氰菊酯、戊唑醇和嘧菌酯5种农药,并且选择低溶度次氯酸钠溶液作为清洗剂,研究鲜切生菜的不同加工阶段对5种农药的降解效率及种农药的体外模拟生物生物可给性。通过研究鲜切生菜加工过程(切、洗和离心)对5种常见农药残留量的影响,评价本加工方法对鲜切生菜农药残留量的降解能力，并确定生菜中这5种常见农药的生物可给性参数,为鲜切蔬菜农药残留对人体健康风险评估提供数据,亦可通过这些参数保障鲜切生菜的质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

10%氯氰菊酯乳油 山东恒利达生物科技有限公司;10%吡虫啉可湿性粉剂 江苏扬农化工集团有限公司;20%虫酰肼悬浮剂 山东京博农化科技有限公司;430克/升戊唑醇悬浮剂 德国拜耳;25%嘧菌酯悬浮剂 先正达(中国)投资有限公司;氯氰菊酯等农药标准品(纯度均大于95%)其理化性质见表1 购自德国Dr.Ehrenstorfe公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(粒径40 μm) 美国Agilent公司;乙腈、甲醇 色谱纯，德国Merck公司;甲酸、乙酸铵 色谱纯，德国Fluka公司;99%的胃蛋白酶、胆汁盐、胰液素 美国Sigma Aldrich公司。

Thermo TSQ Quantum Ultra液质联用仪 美国Thermo公司;安捷伦6890型气相色谱-MSD三重四级杆质谱(HP 5971)联用仪 美国安捷伦和惠普公司;LPD2500多管漩涡混合仪 莱普特科学仪器(北京)有限公司;R-210型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;Sorvall ST 40高速离心机 德国赛默飞公司;WHY-2水浴恒温振荡器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂;AL104-IC电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Milli-Q超纯水装置(>18.3 mΩ) 美国Millipore公司;HX-20C电子恒压喷雾器 台州市椒江禹通农业机械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 生菜样品种植和鲜切生菜加工 生菜田间试验在中国农科院麻类研究所试验田中进行,每个处理小区面积30 m2,重复3次,按照农药标签上的施药剂量(见表1)由电子恒压喷雾器喷施,全程不施用农药的小区作为空白对照,生菜原始样本于农药最后一次喷施2 d后进行随机多点采集,采收后将生菜样本置于塑料袋中,立即用冷藏保温盒运回实验室进行处理。采收后的样品分两部分,一部分(约1 kg)不进行任何加工程序直接制备成分析样品,立即进行萃取测定或制备成分析样品置于-18 ℃冰柜中冷冻保存,剩下的生菜按照切-洗-离心的顺序进行加工成鲜切生菜,立即进行萃取测定或制备成分析样品置于-20 ℃冰柜中冷冻保存。

加工保存过程:新鲜生菜用切菜机迅速切成约30 mm×60 mm片状大小,在装有0.1%的次氯酸钠水溶液的振动水槽中清洗5 min,接着用自来水冲洗5 min用以去除残留的氯离子,随后将清洗后的生菜进行100 g离心5 min去除多余的水分,处理后的生菜用塑料包装袋进行包装,每袋约100 g,置于10 ℃恒温恒湿冰箱中避光保存,分别于保存后1和5 d取不同保存时间样品。每一步加工处理后的样品立即制备成分析样品置于-20 ℃冰柜中冷冻保存。

表2 5种农药的LC-MS/MS和GC-MS实验参数Table 2 LC-MS/MS and GC-MS experimental parameters of five pesticides

1.2.2 样品色谱分析 前处理参照文献中的QuEChERS方法[13],并进行改进后,进行前处理的萃取和净化。称取均质的生菜样品5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中,再加入10.0 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液、600.0 mg无水MgSO4和1.0 g氯化钠,振荡提取10 min,在5000 r/min下离心5 min,取出乙腈层于100 mL鸡心瓶中,再加10 mL乙腈重复提取1次,均质离心后合并乙腈层,将提取液于40 ℃水浴旋转蒸发至约0.5 mL。少量多次加入乙腈涡旋溶解并定容至10.0 mL,取5.0 mL于预先加入80.0 mg PSA填料的离心管中,涡旋提取15 s,在5000 r/min下离心5 min,取上层提取液1.0 mL过0.45 μm有机相滤膜后,上机分析测定。

1.2.3 标准储备液和工作溶液的配制 农药标准储备液(40 μg/mL)的配制:取适量的农药标准物质,用甲醇稀释成40.0 μg/mL的储备液,于-20 ℃冰箱避光保存。准确吸取一定体积的各农药标准储备液,用甲醇定容,得到5种农药1.0 μg/mL的标准中间液,于-20 ℃冰箱避光保存。基质标准液的配制:称取10.0 g空白生菜样品共7份,进行样品1.2.2的前处理过程后,由此获得空白基质液。根据需要,准确吸取一定量的各农药标准中间液或标准储备液于1.0 mL容量瓶中,用空白基质液定容,配制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L系列标准溶液,现配现用,以峰面积(y)和质量浓度(x)作标准工作曲线,采取外标法定量。

1.2.4 色谱和质谱条件参照文献中的色谱和质谱条件[13],优化吡虫啉和虫酰肼测定的LC-MS/MS条件:色谱柱Agilent Zorbax SB-C18反相色谱柱(2.1 mm×50 mm,3.5μm);柱温30 ℃;进样量5.0 μL;流速:0.4 mL/min;流动相 A相为含0.1%(V/V)甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液,B相为纯甲醇;二元梯度洗脱分离,洗脱程序:0～2 min,80% A;2～13 min,80% A～60% A;13～17 min,60% A～40% A;17～20 min,40% A～20% A。质谱采用电喷雾离子源(electrospray ion source,ESI),电喷雾电压5500 V,喷雾气压力40 psi,采用多反应监测(MRM)模式,选择监测离子(m/z)见表2,正负离子模式扫描。

参照文献中的色谱和质谱条件[13],优化氯氰菊酯、戊唑醇和嘧菌酯测定的GC-MS条件:气相色谱条件,进样口温度:280 ℃,不分流进样,进样体积:2 μL;色谱柱:Agilent HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);色谱柱升温梯度:初始温度70 ℃,以25 ℃/min升至230 ℃,再以5 ℃/min升至260 ℃,再以10 ℃/min升至280 ℃(保持6 min),再以5 ℃/min升至290 ℃(保持3 min);载气:高纯氦气(99.999%),载气流量:1.2 mL/min。质谱电离方式:电子轰击离子源EI;电子能量:70 eV;GC-MS接口温度:280 ℃;离子源温度:230 ℃;四级杆温度:150 ℃;溶剂延迟时间:5 min;扫描方式:选择离子监测(SIM)模式;选择监测离子(m/z)见表2。

1.2.5 模拟体外生物可给性 实验模拟胃蛋白酶溶液配制:准确称取胃蛋白酶16.0 g,加入0.10 mol/L HCl溶液溶液溶解后,定容至100.0 mL。模拟肠液溶液配制:准确称取胰液素0.4 g、胆汁盐2.5 g、碳酸氢钠0.84 g,用适量MIlliQ超纯水溶解后,定容至100.0 mL。

参照文献中的体外胃肠模拟实验方法[14],准确称取5.0 g通过空白基质加标添加5种农药(0.2、0.5、1.0 mg/kg三个添加水平)的供试生菜的均质样品于50 mL反应器中,加入20.0 mL模拟胃蛋白酶溶液调节pH至 2.0,在37 ℃ 100 r/min恒温振荡器中水浴振荡消化2 h;随后加入20.0 mL模拟肠液溶液调节pH至 7.0,在37 ℃ 100 r/min恒温振荡器中水浴振荡消化2 h;对模拟胃液和肠液消化后的样品参照1.2.4方法进行农药残留分析测定。生物可给性结果计算公式如下:

式中:BA:目标化合物的生物可给性;C1:模拟胃肠消化液中的目标化合物的浓度μg/mL;V1:反应器中模拟胃液或模拟肠液的体积,mL;C:供试生菜样品中目标化合物的浓度,mg/kg;M:加入反应器中的供试生菜样品质量,kg。

生物可给溶度结果计算公式如下:

W=w×BA

W:生物可给溶度mg/g;w:样品中农药的含量mg/g;BA:目标化合物的生物可给性%。

表3 生菜中5种农药的线性回归系数、加标回收率及其相对标准偏差Table 3 Regression coefficients(R2),recovery and relative standard deviation(RSD)of five pesticides

1.3 数据处理

采用Excel表格进行数据统计和作图,利用SPSS软件对数据进行统计分析,两个处理数据采用t检验进行比较,两个以上处理数据采用两因素方差分析(Two-way ANOVA)进行比较,P<0.05视为不同处理具有显著性差异的判定标准。

2 结果与分析

2.1 色谱分析方法确证结果

5种农药标准系列溶液按照1.2.4的方法进行色谱分析,每个质量浓度进样3次,以质量浓度为x轴,峰面积为y轴,绘制标准曲线,得到上述5种化合物的线性回归方程及相关系数,结果见表3。结果显示,上述5种农药的线性决定系数R2在0.9992～1.0000之间,能满足定量分析要求。

以0.1(1倍定量下限1 LOQ)、1 mg/kg(10倍定量下限10 LOQ)2个水平添加混合标准液到空白生菜样品中,按1.2.4的方法进行分析,每个添加水平进行10次重复,计算生菜中各农药的回收率及相对标准偏差,结果见表3。结果显示,生菜中5种农药的平均回收率在72.4%～93.2%之间,相对标准偏差在2.69%～9.29%之间。表明本方法的准确度和精密度均符合农药残留分析要求[15],能够满足实际样品的残留检测分析。

2.2 鲜切生菜的加工和保存过程对农药残留的影响

生菜在未加工和不同阶段加工过程中农药残留水平见图1。结果表明,鲜切生菜加工的不同阶段对所有农药的影响有相似之处,5种农药残留在经过鲜切生菜标准化加工程序后的农药残留均在最大农药残留限量以下,且在用次氯酸钠溶液洗涤时均出现显著性下降(P<0.05),洗涤过程(包括次氯酸钠冲洗和自来水冲洗)去除的农药残留均大于80%。切割过程生菜中的农药会随着汁液流出,这样切割后生菜中的农药残留就会相应下降,吡虫啉和戊唑醇残留在切割时就出现了显著性的下降(P<0.05),其他农药残留下降不显著(P>0.05)。在切割和洗涤过程,农药残留去除最多的是虫酰肼,减少了62.9%,氯氰菊酯次之,减少了49.5%,而嘧菌酯、戊唑醇和吡虫啉分别减少了47.5%、46.9%和42.4%。与离心前相比,离心过程去除农残较少,农药残留没有出现显著性下降。而低温冷藏保存过程中农药残留量随着冷藏时间的延长越来越低,但没有出现显著性下降。

图1 加工和储藏过程中的生菜农药残留水平Fig.1 Pesticide residues in lettuce during processing and storage注:不同小写字母表示同种农残 不同处理后的水平差异显著P<0.05。

一些研究表明应用典型家庭清洗处理的西葫芦的6种农药残留可减少70%～80%[16];而对豇豆进行不同清洗方式的研究中发现,冲洗和振动清洗较浸泡清洗对农药残留的清除效果好[11];利用不同清洗剂对叶类蔬菜中的农药残留进行清除表明结果,2%食盐水和2% NaHCO3对叶类蔬菜中农药残留的清除效果较清水好,且不同清洗剂对不同农药的清除效果有差异[8];黄瓜中的研究也表明,清水清洗黄瓜后7种农药降解率在27.17%～80.00%之间,而清洁剂清洗的降解率可达33.33%～90.00%[10]。本研究中采用低溶度次氯酸钠水溶液清洗生菜,清除农药残留效果好、成本低,一方面可以去除生菜中的农药残留,另一方面可以起到杀菌消毒的作用,抑制微生物的生长繁殖,维持鲜切生菜的感官品质[17-18]。而不同农药残留的降解率差异可能与农药的物理化学特性有关的,如一些研究表明,农药的Kow值可能和洗涤过程中农药残留物的减少有关[19]。另鲜切生菜制作好后需要进行包装销售,对其储藏环境要求为低温环境,通过研究冷藏保存对生菜农药残留的影响发现，农药残留量随着冷藏时间的延长而有所降低,但在实际操作过程中还需考虑冷藏时间对生菜营养和外观品质的影响,选择合适冷藏时间。在黄瓜中的研究也表明,在5 ℃贮藏条件下,黄瓜中的农药残留量随着冷藏时间的延长越来越低,10 d后黄瓜中7种农药的降解率达38.9%～58.3%[10]。

表4 鲜切生菜不同加工阶段5种农药的加工因子Table 4 Processing factors of cutting,washing,centrifuged and whole process on pesticide residues in fresh-cut lettuce

表5 体外胃肠模拟中农药的生物可给性Table 5 Bioavailability of pesticides in vitro gastrointestinal simulatedtests

加工因子PF(processing factor)是指产品中农药残留量与原料中的农药残留量比值[20]。如果该值小于1,则表明农药残留降低,且数值越小,清除效果越好;如果该值大于1,则表明残留农药发生浓缩,且数值越大则浓缩倍数的越高。不同农药及不同操作的加工因子见表4。结果表明,鲜切生菜全加工过程加工因子虫酰肼<氯氰菊酯<戊唑醇<嘧菌酯<吡虫啉,说明鲜切生菜加工过程对虫酰肼的清除效果最好,氯氰菊酯次之,对吡虫啉的清除效果最差。结果还表明,鲜切生菜在加工后全过程对5种农药的加工因子均小于或等于0.5,说明消费加工过的鲜切生菜较消费新鲜生菜的风险更低。

2.3 5种农药的生物可给性

表5给出了体外胃肠模拟环境中5种农药的生物可给性溶度和生物可给性,结果表明氯氰菊酯、戊唑醇和嘧菌酯在任何浓度下均可被生物利用,而吡虫啉和虫酰肼只有一定溶度以上才能被生物利用;不同添加水平下,氯氰菊酯的生物可给性均最高,生物可给性依次为:氯氰菊酯>嘧菌酯>戊唑醇>吡虫啉>虫酰肼,但5种农药的生物可给性均未达到50%,说明生菜中这5种农药的安全性还比较好。由表5可以看出在1.0 mg/kg添加水平生菜中的氯氰菊酯、吡虫啉、虫酰肼、戊唑醇和嘧菌酯的生物可给浓度分别为 0.167、0.014、0、0.074和0.128 mg/kg。通过与供试农药的ADI值(见表1)比较发现,氯氰菊酯、吡虫啉和虫酰肼的ADI值分别为0.05、0.06和0.1 mg/(kg·bw),其慢性毒性大小相近,而虫酰肼的生物可给浓度为0 mg/kg,吡虫啉的生物可给浓度为0.014 mg/kg,远低于氯氰菊酯的 0.167 mg/kg,仅为其1/10,因此就生菜中这三种杀虫剂残留对人体的健康风险而言,虫酰肼最安全,吡虫啉比氯氰菊酯更安全。同样的,戊唑醇和嘧菌酯的ADI值为0.03和0.2 mg/kg·bw,而戊唑醇和嘧菌酯的的生物可给浓度为0.074和0.128 mg/kg,因此就生菜中中这两种杀菌剂残留对人体的健康风险而言,嘧菌酯比戊唑醇更安全。

3 结论

通过研究三种杀虫剂(吡虫啉、虫酰肼、氯氰菊酯)和两种杀菌剂(戊唑醇、嘧菌酯)在模拟商用鲜切生菜不同加工过程中的耗散情况,发现鲜切生菜加工过程对于减少农药残留具有重要作用。不同加工处理加工因子均低于1,全加工过程加工因子虫酰肼<氯氰菊酯<戊唑醇<嘧菌酯<吡虫啉,说明鲜切生菜加工过程对虫酰肼的清除效果最好,氯氰菊酯次之,对吡虫啉的清除效果最差。而5种农药残留在用次氯酸钠洗涤时均出现显著性(P<0.05)下降,说明次氯酸钠洗涤过程对于农药的去除率最高,下一步将深入研究不同洗涤方式清除农药的效果,并开发绿色、清洁、廉价的鲜切生菜洗涤方式。

而体外胃肠模拟环境中5种农药的生物可给性反映了农药对人体的直接暴露风险,5种农药的生物可给性均未达到50%,结合农药生物可给性和ADI数据,发现杀虫剂虫酰肼最安全,吡虫啉比氯氰菊酯更安全,杀菌剂嘧菌酯比戊唑醇更安全。这些研究可以为评估鲜切蔬菜农药残留对人体健康风险提供基础数据,同时对于保障鲜切生菜的质量安全具有重要意义。