一种红棕色真菌色素稳定性的初步研究

陈 鑫，杨解解，薛鹏飞，刘俊林

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124）

枸杞（Lycium chincnse Mill）是我国药食同源，历史悠久的名贵中药材。现代药理研究发现枸杞具有多种活性，包括滋补肝肾，预防肿瘤及动脉粥样硬化等重要药用功效[1]。内生真菌是一类长期潜伏于植物体内而不引起植物明显不适的微生物，内生真菌与植物的共生关系使内生真菌能在植物体内产生丰富的次生代谢产物，为色素的开发利用提供了一种新的研究思路[2]。

天然色素有很高的营养价值和药理功能等优越性，且相比于其他色素安全性较高，日益受到重视和青睐。真菌色素是微生物色素中研究和应用最多的一类色素，特别是某些丝状真菌是天然色素的重要来源[3]。但天然色素一般稳定性较差，对光、热、金属离子、pH、氧化剂等因素非常敏感，色价会随着环境条件的变化而发生改变[4]，色素的稳定性决定了其应用范围，可见色素稳定性的研究具有非常重要的意义。本试验通过组织块法、平板划线法从中药材枸杞中分离纯化得到1株产红棕色素的菌株（GQ-16-1）[5]，采用固体培养，萃取，离心提取色素，采用比色法、单因子研究法从酸碱度、温度、金属离子及氧化剂等方面初步探究枸杞内生真菌GQ-16-1所产红棕色素的稳定性[6-9]，旨在为该色素的分离，纯化、鉴定与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞内生真菌菌株GQ-16-1。由西北民族大学生命科学与工程学院细胞与胚胎工程实验室、生化与生物制药实验室共同分离、保藏的中药材枸杞内生真菌菌株GQ-16-1。

1.1.2 PDA固体培养基。马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，定容至1000mL。

1.2 试验方法

1.2.1 红棕色素提取与精制。纯化菌株，制备真菌GQ-16-1悬液并涂布接种于固体PDA培养基，28℃恒温培养至培养基中色素含量饱和，分离菌丝与培养基，弃菌丝保留含色素的培养基，将含有色素的培养基捣碎并浸泡于色素溶解剂（经试验，该真菌色素易溶于水）中，料液比为质量/体积=1/40，振荡过夜，离心，得到色素溶液，将色素溶液真空冷冻干燥得到干品色素，4℃保藏。

1.2.2 红棕色素测试溶液配制。将干品色素溶于蒸馏水中，精确制成浓度为0.001g/mL的测试用色素溶液。

1.2.3 红棕色素的光谱特性。以溶剂为空白对照，先用紫外可见分光光度计在300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm波长下对色素测试溶液进行扫描，测定一个范围，再减小波长组距精确扫描，观察其吸收光谱特性，确定其最大吸收波长λmax。

1.2.4 pH值对色素稳定性的影响。用蒸馏水、NaOH、HCl配置 pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的酸碱试验试剂，分别加入色素测试溶液中（色素测试溶液与酸碱实验试剂的比值为3∶1），摇匀。将色素测试溶液与蒸馏水按3∶1混合做对照，静置2h，观察并记录，在最大吸收波长下分别测定不同pH值条件下色素溶液的吸光度。

1.2.5 温度对色素稳定性的影响。取9支试管分别加入5mL 色素测试溶液，标记编号 1、2、3、4、5、6、7、8、9，分别放置于 20、30、40、50、60、70、80、90 和 100℃水浴条件下加热30min，观察并记录溶液颜色，在最大吸收波长下分别测定不同温度条件下色素溶液的吸光度。

1.2.6 金属离子对色素稳定性的影响。将含有金属离子的盐类（CaSO4、K2CrO7、Na2CrO7、BaSO4、Al2（SO4）3、Cu-SO4、FeCl3、FeCl2、MgCl2）配制成金属离子浓度为0.2mg/mL的金属离子实验试剂。分别把色素测试溶液与各金属离子实验试剂混合摇匀（色素测试溶液与金属离子实验试剂的比值为3∶1），将色素测试溶液与蒸馏水按3∶1混合做对照，静置2h，观察并记录，在最大吸收波长下分别测定不同金属离子条件下色素溶液的吸光度。

1.2.7 氧化剂对色素稳定性的影响。将具有氧化性的盐类（K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、浓 H2SO4、浓 HCl、浓 HNO3、K2MnO4，NaClO）配置成浓度为0.2mg/mL的氧化剂实验试剂。分别把色素测试溶液与各氧化剂实验试剂混合摇匀（色素测试溶液与氧化剂实验试剂的比值为3∶1），将色素测试溶液与蒸馏水按3∶1混合做对照，静置2h，观察并记录，在最大吸收波长下分别测定不同氧化剂条件下色素溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 真菌菌株固体培养和红棕色素测试溶液图

枸杞内生真菌菌株GQ-16-1在接种的第3天开始产生红棕色色素，第10天色素达到饱和。图1中真菌GQ-16-1已培养至第10天，色素含量达饱和，图2为采用固液萃取，离心提取色素，真空冷冻干燥的提取工艺得到的色素配制而成的色素测试溶液，该色素极易溶于水，其水溶液澄清透明，色泽鲜艳。

图1 真菌菌株固体培养图

图2 红棕色素测试溶液图

2.2 红棕色素的光谱特性

图3表明，该红棕色素测试溶液在波长350nm处有最大吸收峰，其吸光度值为1.670。

图3 色素特征吸收光谱曲线

图4 pH值对色素稳定性影响

2.3 pH值对色素稳定性的影响

pH值对红棕色素稳定性的影响结果如图4所示，该图表明在pH值2～8之间，最大吸收波长下测得的吸光度值上下波动，变化不明显。在pH值9～10之间，色素测定溶液的吸光度值有所增加，溶液颜色加深。总体来说，红棕色素对pH变化不敏感。

2.4 温度对色素稳定性的影响

由图5可知，在20～100℃之间，吸光度值上下波动，变化不明显。总体来看，试验认为该红棕色素对温度变化不敏感。

图5 温度对色素稳定性影响

2.5 金属离子对色素稳定性的影响

图6 金属离子对色素稳定性影响

由图6可知，Al3+存在条件下，吸光度值下降，表明Al3+对该红棕色素有明显不良影响。因此，该色素在生产、运输、存储过程中应避免与铝制品接触，也可以添加一些螯合剂如EDTA等来消除金属离子的影响。而Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ba2+、K+（只含 1 种金属离子）存在条件下，其吸光度值上下波动，无明显变化，对色素稳定性无显著影响。

2.6 氧化剂对色素稳定性的影响

图7 氧化剂对色素稳定性影响

图7表明，强氧化剂NaClO对红棕色素测试溶液有明显增色效果，且无沉淀产生，因此在非食品应用的实际生产中可适量添加NaClO来增加该红棕色素的色泽。而K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、浓H2SOA、浓HCl、浓HNO3、K2MnO4（只含1种氧化剂）存在条件下，其吸光度值上下波动，对红棕色素稳定性无显著影响。

3 结论与讨论

通过对枸杞内生真菌GQ-16-1所产红棕色素的初步研究，发现该红棕色素为水溶性，最大吸光值出现在350nm处，吸光度值为1.670。在pH值2～10稳定，偏碱性颜色加深。在温度为20～100℃稳定，说明该色素适用范围广，不受温度限制。金属离子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ba2+、K+（只含1种金属离子）对色素稳定性基本无影响，Al3+对色素稳定性有不良影响，因此该色素在应用、制备与保存时都应避免与铝制品接触。强氧化剂NaClO对其有明显增色效果，在K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、浓 H2SO4、浓 HCl、浓 HNO3、K2MnO4（只含1种氧化剂）中稳定存在。

真菌作为一种重要的色素产生菌，在其他研究中早有报道[10]，如链霉菌、三孢布拉霉菌、产紫青霉等，本试验发现的这株产红棕色素菌株是对产色素菌的进一步丰富。试验采用固液萃取，离心提取色素，真空冷冻干燥的提取工艺，不仅简单易操作，而且提取效率高，不易对色素本身品质造成损害。且溶剂为水，降低成本的同时也不易造成环境污染。采用比色法，单因子研究法测试该色素稳定性时，肉眼所见颜色无明显变化并且吸光度值变化不大则认为对该色素稳定性无影响。在研究金属离子对色素稳定性的影响时，实验试剂用盐类配制，含有其他离子，因此理论上存在误差。真菌色素使用的最大障碍是毒素的检测，而本研究未对色素进行毒理性研究，因此其安全性研究还需进一步开展。另外，还需研究该色素提取工艺的优化及菌株生长条件的优化，使其能尽早应用于生产。此外，本研究只对色素稳定性进行了初步研究，该色素的生物学活性方面有待深入研究，为开发抗氧化、抑菌、保健等功能色素奠定基础，提升其应用价值。