BAPTA类荧光探针的离子识别性能研究与结合机制分析

周磊，喻晓，王雪凯，苗延青，成昭

（西安医学院药学院药物化学研究所，陕西西安710021）

20 世纪 80 年代初，钱永健教授（Roger Y. Tsien）课题组针对EGTA[双（β-氨基乙基）乙二醇醚 -N，N，N'，N'- 四乙酸 ]进行结构修饰，合成了一系列类似于EGTA结构的新型螯合剂BAPTA[1，2-双（2-氨基苯氧基）乙烷 N，N，N'，N'- 四乙酸 ][1-3]及其衍生物，进而以BAPTA作为识别基团、引入荧光发色团，合成了第三代小分子荧光探针以苯环取代EGTA结构中与N、O相连的亚甲基得到BAPTA，利用其结构中4个羧基所成的环状结构发生离子识别作用。

本文基于ICT（分子内电荷转移，Intramolecular Charge Transfer）机制[4]设计荧光探针结构，以经典BAPTA母环为所设计荧光探针识别基团的基础，引入苯乙烯类发色团--苯并咪唑[5-7]作为荧光发色团，以光谱分析手段分析探针在水体系中的离子识别性能；结合单晶结构研究BAPTA受体中四羧基进行离子包结孔隙的形成；进而根据ICT机制及离子电子层排布等特性，分析探针对离子识别性能的差异及与离子结合等识别机制问题。针对探针结构与离子识别机制问题的研究，能够辅助完成荧光探针结构中识别基团与荧光发色团的构筑与设计，优化探针性能，为新型小分子荧光探针的设计与开发提供重要思路。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

XT-4B型显微熔点仪，北京泰克科技有限公司；EQUINOX-55型红外分光光度计，美国布鲁克科技有限公司，KBr压片法；LCQ Advantage MAX LC/MS/MS型高分辨质谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；AVANCE III型超导核磁共振波谱仪，美国布鲁克科技有限公司，400 MHz；Smart APEX II CCD型X射线单晶衍射仪，美国布鲁克科技有限公司；UV-2012C/PC/PCS型紫外-可见分光光度计，美国尤尼柯仪器有限公司；LS-55型荧光分光光度计，美国铂金埃尔默仪器有限公司。

实验所用试剂2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、(i-Pr)2NEt、溴乙酸甲酯等均为化学纯，市售。

1.2 实验方法

以2-硝基苯酚及1-溴-2-氯乙烷为初始原料，经6步反应合成得到目标BAPTA荧光探针分子N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基 )乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺，合成路线如图1。

图1 探针分子合成线路

(a) BrCH2CH2Cl，K2CO3，DMF，120 ℃，5 h；(b) 2-NO2-Ph-OH， K2CO3，DMF，140 ～ 160 ℃，4 ～5 h；(c) Fe，HCl，EtOH， 回 流 4 h；(d) (i-Pr)2NEt，BrCH2COOCH3，MeCN，回 流 24 ～ 36 h；(e) POCl3，DMF，75 ℃，4 h；(f) 1，2-Ph(NH2)2，H2O2，Fe(NO3)3，50 ℃，30 min。

（1）1-(2-氯乙氧基)-2-硝基苯

将 4.30 g 1- 溴 -2- 氯 乙 烷（0.03 mol）、2.07 gK2CO3（0.015 mol）与 1.39 g 2- 硝基苯酚（0.01 mol）于室温下在DMF（8 mL）中混合均匀，升温至120 ℃，反应约5 h，冷至室温，加入20 mL乙酸乙酯稀释，10 mL水洗3次，有机相经合并、旋干后以甲醇-水（1∶1，V∶V）混合溶剂对粗品进行重结晶[8-9]，得到淡黄色针状结晶1-(2-氯乙氧基)-2-硝基苯。产率 93%，熔点 36 ～ 37 ℃。IR (υ/cm-1):2972.34，2926.51，2875.20，1608.27，1484.98，1522.27，1343.29，1247.30，1026.00，745.61，667.76。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:7.85 (d， J=8 Hz， 1H)，7.53 ～ 7.57 (m， 1H)，7.23 ～ 7.04 (m， 2H)，4.40 (t，J=12 Hz， 2H)，3.86 (t， J=12 Hz， 2H)。

（2）1，2-二(2-硝基苯氧基)乙烷

将2-硝基苯酚（1.39 g，0.01 mol）和K2CO3（2.50 g，0.018 mol）于室温下加入1-(2-氯乙氧基)-2-硝基苯（2.01 g， 0.01 mol）的 DMF（10 mL）溶液中，升温至 140 ℃，反应约 4 h，冷至室温，分散于 20 mL 冰 -水中，经抽滤、10 mL水洗3次、混合溶剂甲醇-水（1∶1，V∶V）重结晶得到黄色针状结晶1，2-二(2-硝基苯氧基)乙烷。产率95%，熔点168～169 ℃。IR (υ/cm-1):3051.66，2956.13，2931.93，2873.61，2760.34，1606.92，1582.83，1484.65，1518.56，1359.96，1278.08，1090.66，744.19，671.99。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:7.83 (d， J=8Hz， 2H)，7.57(t， J=8Hz， 2H)，7.24 (t， J=8Hz， 2H)，7.08 (t， J=8Hz，2H)，4.54 (s， 4H)。

（3）1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷

3.36 g还原铁粉（0.06 mol）、0.2 mL 浓盐酸与10 mL无水乙醇于80℃下混合均匀并回流30 min后，分批次加入3.04 g1，2-二(2-硝基苯氧基)乙烷（0.01 mol），再经回流反应 4 h 后，加入 15% KOH/乙醇溶液调节体系pH为7～8，滤除铁粉并加入6 mol/LH2SO4(aq)至析出足量白色硫酸盐沉淀，沉淀溶于60 ℃热水中，再以饱和NaOH(aq)调节至pH为9～10，得到白色粉末1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷。产率88%，熔点116～117 ℃。IR(υ/cm-1):3432.36，3355.57，3059.23，2934.32，1612.32，1507.94，1276.75，1217.40，941.92，739.95。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:7.05 ～ 6.91(m，8H)，4.36(s， 4H)，3.82(s， 4H)。

（4）N，N，N'，N'- 四 甲氧 酰 亚 甲 基 -1，2- 二 (2-氨基苯氧基)乙烷

将 (i-Pr)2NEt（6 mL，0.05 mol）和溴乙酸甲酯（3 mL，0.05 mol）加入 1，2- 二 (2- 氨基苯氧基 )乙烷（2.44 g， 0.01 mol）的热 MeCN 溶液（10 mL）中，于 80 ℃回流反应 12 h，冷却、加入 20 mL 乙酸乙酯，抽滤、旋干滤液，得到黄色油状物，再向其中加入少量甲醇，室温下搅拌4～6 h、抽滤，再以甲醇重结晶得到白色粉末 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷。产率87%，熔点94～95℃。IR (υ/cm-1):3067.78，2993.00，2951.29，2921.02，2888.20，1748.17，1596.85，1509.53，1173.12，742.49，706.25。1H NMR (CDCl3， 400 MHz)δ:6.89 ～ 6.82(m， 8H)，4.27(s， 4H)，4.15(s， 8H)，3.56(s， 12H)。

（5）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基苯胺

将 POCl3（2.4 mL）于 5 ～ 10 ℃下、40 ～ 45 min内滴加至新蒸DMF（20 mL）中，室温搅拌1～2 h，控制温度为5～10 ℃，将上述混合液滴加至5.32 g N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -1，2- 二 (2- 氨基苯氧基 )乙 烷（0.01 mol）的 20 mLDMF 溶 液 中[4，10]。 升温至 75 ℃，反应 4 h，冷至室温，分散于 100 mL 冰水中，抽滤得固体粗品，柱分离（乙酸乙酯-正己烷，1∶ 1，V ∶ V）得到白色粉末 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基苯胺。产率85%，熔点131～132 ℃。IR (υ/cm-1):3015.76，2954.95，2928.97，1746.40，1681.01，1593.97，1509.15，1245.85，1164.87，747.14。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:9.80(s， 1H)，7.40 ～ 7.37(m，2H)，6.90 ～ 6.81(m， 4H)，6.76(d， J=8.3 Hz， 1H)，4.32 ～ 4.31(m， 2H)，4.27 ～ 4.26(m， 2H)，4.24(s，4H)，4.15(s， 4H)，3.57 (d， J=4.5 Hz， 12H)。13C NMR(CDCl3， 101 MHz) δ:190.47，171.92，171.22，150.12，149.64，145.00，139.27，129.89，126.71，122.17，121.59，118.93，116.49，112.85，110.51，76.98，76.66，67.25，66.64，53.33，51.95，51.76。HRMS ((+)-ESI):m/z = 583.1894 [(M+Na)+calcd.:583.1898， (M+Na)+found: 583.1894]。

（6）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺

将 0.11 g 邻苯二胺（1 mmol）和 0.56 g N，N，N'，N'-四甲氧酰亚甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基苯胺（1 mmol）于室温下溶解于 10 mL 无水乙醇中，再升温至80 ℃，反应4 h、冷却、旋干、柱分离 (乙酸乙酯-正己烷，1∶1，V∶V)得到白色固体 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺。产率80%，熔点 72 ～ 73 ℃。IR (υ/cm-1):3505.95，3033.48，2906.20，1743.33，1509.99，1478.13，1170.58，746.32。1H NMR (CDCl3，400 MHz) δ:7.68 (d， J=8 Hz， 1H)，7.56(s， 3H)，7.17(s， 2H)，6.88 ～ 6.87(m，2H)，6.84 ～ 6.83(m， 1H)，6.72 ～ 6.68(m， 2H)，4.13(s， 8H)，3.91 ～ 3.85(m， 3H)，3.85(s， 2H)，3.54(s，6H)，3.51(s， 6H)。13C NMR (CDCl3， 101 MHz) δ:172.22，171.71，152.15，150.21，149.86，140.84，138.73，122.43，121.35，120.33，118.94，118.15，112.80，111.29，77.41，77.09，76.77，66.90，66.52，53.39，53.31，51.79。HRMS ((+)-ESI):m/z = 649.2499 [(M+H)+calcd.:649.2504， (M+H)+found:649.2499]。

2 结果与讨论

2.1 单晶结构与离子识别孔隙

N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧 基 )乙 氧基 ]-4- 甲 酰 基 苯 胺 及 N，N，N'，N'- 四 甲氧酰亚甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺的单晶从混合溶剂体系乙酸乙酯-二氯甲烷（V∶V，3∶1）中挥发得到，均为无色块状晶体。

（1）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基苯胺

正交晶系，Pna21空间群，每个非中心对称结构单元包含4个分子，分子及晶体结构如图2所示。醛基与苯环扭转角接近180°或0°（C(16)-C(17)-C(21)-O(7)-2.9(10)，C(18)-C(17)-C(21)-O(7)177.8(6)）、醛基与其相连苯环(C15～C20)共平面。此外，两个苯环因柔性桥连原子而处于相垂直角度，二面角经计算得知为89.87°。

图2 N,N,N’,N’-四甲氧酰亚甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基苯胺

两个苯环平面几乎处于垂直排布，通过与邻近氢形成分子内氢键[11-12]，乙酸甲酯链上的O(2)、O(3)、O(4)、O(9)，以及乙氧基的 O(5)、O(6)，在 a 方向堆积形成了孔洞结构。

（2）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺

N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺属C2/c空间群单斜晶系，每个非中心对称结构单元包含8个分子，分子及晶体结构如图3所示。

从接近于180°的扭转角数据 N(2)-C(7)-C(8)-C(13)-172.76(17) Å，N(1)-C(7)-C(8)-C(9) -173.77(17) Å，N(2)-C(6)-C(1)-C(2) -179.52(18) Å 与 C(5)-C(6)-C(1)-N(1) 178.67(18) Å，可得知苯环与苯并咪唑基的共平面结构，该结构中，电子离域范围扩大、平面共轭体系增大，分子荧光增强。

图3 N,N,N’,N’-四甲氧酰亚甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺

N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺的两个苯环互成接近于90°角度 (夹角86.44°)，连接于氮原子上的四条乙酸甲酯链互成角度，通过其氧原子与邻近氢形成分子内氢键。氢键与苯环-苯并咪唑的共平面性综合作用，使分子实现空间有序堆积、于c方向形成显著孔洞结构[13-16]（孔洞率20%），在分子识别领域将具有重要意义。

2.2 金属离子选择性

合成得到荧光探针为乙酸甲酯分子，需通过水解[17-18]得到其游离羧酸盐、进行离子识别，水解路线如图4所示。

图4 乙酸甲酯型探针水解路线

称取 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亚甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺（C33H36N4O10）0.0649 g（0.1 mmol） 与 CsOH·H2O 0.1679 g（1 mmol），于 10 mL 无水乙醇中搅拌回流、反应过夜，冷至室温，旋干溶剂，加入100 mL去离子水，得到浓度为1×10-3mol/L的探针Cs盐溶液。

(1) 乙酸甲酯型探针的荧光激发与发射光谱

进行乙酸甲酯型探针的荧光性质测定，得到其荧光激发与发射光谱如图5。

图5 乙酸甲酯型探针的荧光激发与发射光谱

乙酸甲酯型探针分子的荧光最大激发与发射波长为 λex，max= 331 nm，λem，max= 394 nm。将荧光激发光谱与荧光发射光谱重叠，得到荧光激发光谱与荧光发射光谱的镜面对称关系[19-21]，斯托克位移为63 nm。

（2）探针的金属离子选择性

进行探针对金属离子特异选择性的光学性质分析，得到探针-金属离子的荧光光谱图6及紫外-可见吸收光谱图7。

图6 探针的金属离子选择性

图7 探针-金属离子体系的紫外光谱

从荧光光谱图6来看，探针对Zn2+表现出增强型的识别，对Cu2+和Hg2+具有猝灭型响应。对比来看，图7中紫外吸收谱峰无明显变化。由探针ICT识别机制可知，荧光发射波长变化因探针-金属离子配位作用中电子转移引起，对分子吸收基本无影响，因而紫外光谱无显著变化。

2.3 探针的识别机理分析

经过荧光光谱进行离子识别筛选，可知探针对Zn2+具有增强型识别，对Cu2+和Hg2+均具有猝灭型响应，紫外光谱无显著变化。结合探针结构设计与ICT电荷转移-分子识别机制，分子内同时具有电子给体和电子受体、探针分子结构中荧光发色团与识别基团直接相连，识别基团结合目标物时，影响分子内推-拉电子作用、减弱或强化分子内电荷转移、导致荧光光谱变化。

共价键形成之后，探针BAPTA识别部分的氮仍存在孤对电子、具有给电子性，此时，不饱和环可作为分子中的电子受体，内电子转移使探针分子表现出特征荧光性质。当结合金属离子时，由氮及羧基氧提供孤对电子、金属提供空轨道进行弱配位，进而减弱了氮的给电子性，完全阻断或部分削弱内电子转移路径，导致探针分子荧光猝灭或荧光强度降低。此外，过渡金属通过自旋-轨道耦合、电子或能量转移，能够使荧光发色团发生荧光猝灭现象。上述两点致使探针与Cu2+、Hg2+作用时发生荧光猝灭。而基于Irving-Williams规则，Cu2+、Hg2+配位稳定性均强于Zn2+，且Zn2+相比于Cu2+，极化能力与变形性较弱、空轨道较少、配位作用弱，而还原性却远大于Cu和Hg，导致Zn2+接受氮孤对电子的能力远小于Cu2+与Hg2+，因而在识别过程中，探针-Zn2+体系呈现与探针-Cu2+/Hg2+相反的作用方式。

3 结论

基于目前研究工作中尚不明确的BAPTA与离子识别、结合机制等相关问题，本文基于ICT机制设计荧光探针结构，以经典BAPTA母环作为荧光探针识别基团，通过荧光光谱研究水体系中探针的离子识别性能，发现探针对Zn2+具有增强型识别，对Cu2+和Hg2+均具有猝灭型响应；进一步结合紫外-可见光谱分析手段、并进行探针单晶结构表征，发现BAPTA受体中四羧基包结孔隙与离子识别作用的相关性；进而根据ICT机制及电子特性分析探针对离子识别性能的差异，研究探针-离子结合等识别机制问题。进行探针结构与离子识别机制等问题的研究，能够在未来研究工作中有效设计有机小分子荧光探针的识别基团与荧光发色团，优化与改观探针性能，为新型探针的设计与开发提供重要思路。