恶性疟原虫动物模型及基因编辑研究进展

匡德宣， 王文广， 孙晓梅， 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队， 昆明650118)

疟原虫是引起疟疾的主要病原体， 疟疾与艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球亟需控制的公共卫生问题， 是联合国千年发展目标中重点防控的3种传染病之一[1]。目前发现的可寄生人体的疟原虫有五种： 恶性疟原虫(Plasmodium. falciparum)、间日疟原虫(P. vivax)、三日疟原虫(P. malariae)、卵形疟原虫(P. ovale)和诺氏疟原虫(P.Knowlesi)，其中对人类危害最严重的是恶性疟原虫。自从1880年Laveran 在恶性疟病人血液中发现疟原虫以来， 疟疾仍是全球范围内危害最严重的寄生虫病之一， 目前全球有 99个国家和地区流行疟疾， 约33亿人受到疟疾威胁， 每年约有 2亿疟疾病例， 66万人死于疟疾感染[2]。在世界范围内， 人类对人疟原虫生理、生化、感染和慢性致病机制、药理免疫以及人疟原虫疫苗的研制等方面进行深入研究，均离不开合适的动物模型。虽然科学家曾尝试使用非人灵长类、免疫缺陷小鼠、转基因技术等开展恶性疟原虫动物模型研究，但结果各有优缺点。本文对恶性疟原虫动物模型及基因编辑研究做一综述，以供参考。

1 恶性疟原虫体外培养模型

恶性疟原虫是人体感染疟原虫种类中致死率最高的虫种，同时也是目前研究最多并唯一能在体外进行长期培养的疟原虫虫种[3]。Geiman等[4]用恶性疟原虫证实美洲夜猴可作为人疟原虫的实验宿主， 揭开了体外连续培养疟原虫的序幕。随后Trager等[5]通过改进形成烛缸静止法和流动瓶法，取得了恶性疟原虫红内期(erythrocytic stage)体外培养的历史性突破，首次报道了从夜猴身上引种的人恶性疟原虫抗氯喹株成功进行体外连续培养，建立了恶性疟原虫越南FVO株的连续培养方法。1983年云南省疟疾防治研究所成功培养一株恶性疟原虫，此后培育出12个分离株，建立了适合体外生长的虫库[6]。Fandeur等[7]用松鼠猴红细胞对恶性疟原虫进行体外培养，虽然恶性疟原虫在松鼠猴红细胞内连续生长时间未超过3周，但已为人恶性疟原虫松鼠猴动物模型的研究打下了坚实基础。谢苑灵等[8]应用体外连续培养恶性疟原虫的方法对黑叶猴、熊猴、红面猴、猕猴、果子狸、长爪沙鼠、家兔、白掌长臂猿(泰国产)等8 种动物进行易感性实验，研究结果显示，黑叶猴、熊猴、红面猴、猕猴、果子狸、长爪沙鼠以及家兔均属不易感动物，而在白掌长臂猿则显示相当的易感性。通过对各种动物进行人恶性疟原虫体外连续培养的易感性试验将为人疟原虫动物模型的研究提供了一种准确、快速、节约的好方法。

迄今， 国外学者[9]相继建立了4种人类疟原虫红外期(exo-erythrocytic stage)体外培养技术以及恶性疟原虫标准虫株， 已广泛应用于抗疟药物敏感性研究、抗疟药物筛选、抗药性疟原虫培育与抗性消长等各个领域， 并以此为基础开展了有关的疟原虫生物学与免疫学研究， 带动了疟原虫免疫、生理、生化、疫苗研制、诊断等学科的发展。恶性疟原虫体外培养的成功，不仅可以在人疟原虫的某些研究领域取代来源困难、价格昂贵的模型动物，又为开展其它疟原虫的体外培养研究提供了借鉴方法。

2 恶性疟原虫体内感染动物模型

2.1 恶性疟原虫感染类人猿模型

Mesnil等[10]首先报告以间日疟原虫和恶性疟原虫感染黑猩猩(chimpanzee)获得成功，该报告曾被认为是人疟原虫接种动物获得成功的第一个纪录，但3年后他们自己否定了以间日疟原虫和恶性疟原虫接种黑猩猩获得成功的观点[11]。Rodhain等[12]相继作了间日疟原虫接种黑猩猩获得成功的报道，接种前把黑猩猩脾脏切除，在短时间内可以产生高度的虫血症。描述了疟原虫在黑猩猩体内的全部繁殖过程，还肯定了切除脾脏是建立疟原虫模型的有效手段。虽然如此， 但对黑猩猩作为人疟原虫模型的深入研究始于1950年代末期。黑猩猩对间日疟原虫和恶性疟原虫都有一定的感受性，但对间日疟原虫的感受性较好[13，14]。Cadigan 等[15]首先发现泰国的白掌长臂猿(Hylobat eslarlar)对恶性疟原虫的血液传播有部分的感受性， 证明用恶性疟原虫血液传播或蚊传播均可使切除脾脏的白掌长臂猿产生虫血症。随后也有学者[16]做了这方面的研究， 结果均不理想。黑猩猩和白掌长臂猿由于其自身的局限性——数量极少， 正面临种群灭绝; 体形大， 对饲养和管理要求高; 费用昂贵，不易获得等因素限制了其在疟原虫研究中的应用。

2.2 恶性疟原虫感染夜猴模型

Taliaferro等[17]用恶性疟原虫接种到巴拿马产的吼猴(Aloutta palliata)婴猴体内， 取得令人鼓舞的进展， 被西方大部分学者认为人疟原虫接种动物获得成功的第一个确凿记载， 是美洲夜猴(Aotus trivirgatus)取得真正成功的先导。Young等[18]首先以间日疟原虫患者的血接种夜猴获得成功，是人疟原虫动物模型研究中的最大突破。Gieman等[19]报道以恶性疟原虫患者的鲜血接种于切除脾脏的夜猴， 第1代原虫的密度可达 1.8 × 105个 /mm3， 连续传代， 被寄生的红细胞率可以达到87%。Hickman等[20]实验结果与上述结果略有出入，但他们发现切除脾脏和未切除脾脏的夜猴对恶性疟原虫的感受性颇为相近： 第1次转种传代8 d时切除脾脏的夜猴疟原虫密度达到3×105个/mm3，而未经切除脾脏的夜猴在接种14 d时也能达到同样的水平。Contaeos等[21]实验证明夜猴体内所产生的恶性疟原虫的配子母体对弗氏按蚊(anopheles freeborni)有高度感染力， 病猴体内的血对弗氏按蚊的感染力可维持40 d， 其中16 d时猴血对该蚊的感染力竟达100%， 而在一个蚊胃中的卵囊数目可超过50个， 受染的蚊可以将恶性疟原虫回传给健康人。从上述文献看来，夜猴作为恶性疟原虫动物模型是比较理想的，可应用于恶性疟原虫的生理、生化、病理、药理和免疫等各方面的研究。

2.3 恶性疟原虫感染猕猴、熊猴及松鼠猴模型

江静波等[22]建立了恶性疟原虫感染猕猴(Macaca mulatta)和熊猴(Macaca assamensis)模型。将19只熊猴和猕猴切除脾脏后，静脉接受广西百色地区一位恶性疟原虫患者的鲜血。当原虫密度达到高峰期，通过换人血方法使恶性疟原虫在猕猴与熊猴之间转种传代。接种或转种后逐日检查发现恶性疟原虫在猕猴和熊猴体内繁殖及其原虫密度和患病程度有明显差别。5只猕猴和3只熊猴出现高虫血症，原虫密度均在20%以上，出现严重贫血、衰竭及内脏大出血等脑型疟死亡。Gysin等[23]在建立恶性疟原虫感染松鼠猴(Saimiri sciureus)模型中也发现了类似的结果。将部分松鼠猴在接种前切除脾脏，另一部分未切除脾脏，然后静脉接种感染恶性疟原虫，经临床和生化观察，部分松鼠猴出现运动性神经障碍及深度的昏迷的神经症状，疟原虫感染红细胞(parasitized red blood cells， PRBC)在脑血管的堆积率为49%～60%， 出现弥漫性脑水肿， 最终死于脑型疟。从上述研究可以看出， 感染恶性疟原虫的灵长动物中猕猴、熊猴及松鼠猴无论切除脾脏与否都可能发展成为脑型疟症状，这与人类脑型疟的发生颇为相似。尽管恶性疟原虫感染松鼠猴及熊猴发展成脑型疟是不可预见的，但是通过非人灵长动物模型可更进一步认识脑型疟的病理机制。

2.4 恶性疟原虫感染免疫缺陷小鼠模型

近年来， 科研人员尝试将免疫缺陷动物用于恶性疟疾的基础性研究。目前应用于疟疾研究的免疫缺陷动物主要有重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID) 小鼠和BXN小鼠。SCID小鼠根据遗传背景的差异，包括C.B-17-scid小鼠、NOD LtSz-SCID小鼠和HRSJ (hr hr)-scid小鼠等。BXN小鼠 (bg bg·xid xid·nu nu)又称NIH-Ⅲ小鼠，是bg基因、xid 基因和nu基因3基因突变小鼠。Tsuji等[24]用人类红细胞 (human red blood cells，HRBC)代替SCID小鼠红细胞，切除小鼠的脾，获得了较为稳定的原虫血症，建立了恶性疟疾C.B-17-scid小鼠模型。Moore等[25]应用人恶性疟原虫体外预适应法(使疟原虫在体外培养时就逐渐适应SCID小鼠血清或血浆或腹水)和脾脏切除术，建立了恶性疟疾NOD LtSz-scid 小鼠模型，结果表明，从该模型中分离出来的疟原虫不仅在形态上与体外培养体系中的疟原虫相同，而且具备再侵入其他新鲜未被疟原虫感染的HRBC的能力。此外，NOD LtSz-scid小鼠模型中的有性期疟原虫配子体还具备对蚊媒的传染力。Badell等[26]用BXN小鼠建立了恶性疟疾的BXN小鼠模型， 他们使用了二氯甲基磷酸(dichloromethylene diphosphonate，Cl2MDP)和抗多形核中性粒细胞的单克隆抗体 NIMP-R14，以降低组织中巨噬细胞和血中多形核中性粒细胞的数目，同时将已感染恶性疟原虫的HRBC注射入BXN小鼠腹腔内，然后每隔3～4 d，通过腹腔内注射补充健康的HRBC，获得长达120 d的稳定虫血症，虫血率约0.1%～5%，虽然低于南美灵长类动物模型， 但接近于感染者体内的虫血率水平， 其每日变异度也与未经治疗患者体内的虫血症相似[27]。这表明，如果恶性疟疾的BXN小鼠模型能被众多研究者认同，那么它将在恶性疟疾的研究中被广泛推广。Moreno等[28]用单克隆抗体NIMP-R14和脂质体包裹的氯屈膦酸二钠(clodronate)对NOD LtSz-SCID小鼠和BXN小鼠的免疫系统进行调节，观测恶性疟原虫能否在这2种小鼠体内存活以及存活的繁殖时间，并将NODLtSz-SCID小鼠模型和BXN小鼠模型进行对比研究，他们的研究数据显示，NOD LtSz-SCID小鼠模型的恶性疟原虫的感染率高于BXN小鼠模型，主要原因可能在于组织中巨噬细胞募集的减少。巨噬细胞与多形核中性粒细胞作为机体非特异性免疫防御系统的重要成员，在SCID小鼠和BXN 小鼠体内也大量存在，承担着过滤清除体外入侵的病原体、体内产生的有害物和无用物质的作用。使用免疫调节剂下调这2类细胞的数量及功能，可能有助于延长免疫缺陷小鼠体内恶性疟原虫和人红细胞的存活时间，并建立稳定的恶性疟疾红内期感染的动物模型。

总上所述，尽管科学家们尝试建立类人猿、夜猴、猕猴、熊猴及松鼠猴和免疫缺陷小鼠等恶性疟原虫动物模型，但由于恶性疟原虫有严格的宿主选择性，导致恶性疟原虫动物模型各有优缺点，疟原虫虫血症维持时间较短，虫血率水平较低，尚不能作为成熟模型应用于恶性疟疾的相关研究。因此，建立理想的体内感染动物模型仍然是国内外学者急需解决的问题。

3 转基因及基因编辑恶性疟原虫研究进展

3.1 转基因转染技术在恶性疟原虫研究中的应用

疟原虫的转染过程是将克隆有外源基因序列的质粒导入疟原虫细胞中，转化入细胞中的质粒或以游离体的形式存在，或插入到疟原虫的染色体中。恶性疟原虫经历了漫长的发展才成为实验室可基因操作的物种。Goonewarden等[29]首先进行了疟原虫基因转染的开创性工作，为疟原虫基因转染技术的发展奠定了基础。随后疟原虫基因转染技术发展迅速， 大致经历了从最初短暂转染[30]、稳定转染[31]、转染质粒整合[32]、基因打靶技术[33]，一直到恶性疟原虫基因组的测序计划完成等几个阶段[34]，使我们可以特异性地改变疟原虫基因，为深刻了解疟原虫生物学、致病机制、基因的表达和功能、抗药性机制、疫苗研制等诸多方面的研究都提供了最具根本性的工具[35]。目前疟原虫的转基因技术主要用于疟原虫启动子的序列结构、转录调控、药物抗性机制以及基因功能等方面的研究。

质粒以游离形式存在的转染适于疟原虫启动子的研究。通过对启动子基因序列的缺失，可确定启动子序列中的核心区和调控区。Horrocks等[36]对恶性疟原虫的增生细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen，PCNA)启动子进行了套式缺失分析，发现一个长470 bp的区域和位于转录起始位点上游的290～620bp区域对有效的启动子活性是必需的，去掉该区域则报告基因完全不能表达。另外，利用转基因技术对恶性疟原虫钙调蛋白(calmodulin，CAM)、二氢叶酸还原酶-胸腺嘧啶合成酶(dihydrofolate reductase thymidylate synthase，DHFR-TS)及其它基因的上游调控区进行了检测， 对获得的资料进行分析，恶性疟原虫不同基因启动子的顺式调节因子在核苷酸序列上存在很大程度的差异， 其增强子彼此之间以及与真核细胞增强子间没有明显的同源性，表明恶性疟原虫形成了一套自己独特的与酵母或更高级的真核细胞不同的转录因子。

目前普遍认为， 特异性药物靶点的过表达是引起疟原虫药物抗性的常见机制。一种方法是通过转基因技术可以在重组的疟原虫中模拟这一情形，从而评价潜在的药物靶点过表达机制的相关性。另一种方法是在表达载体上建立一个cDNA文库，并将这一文库转染入疟原虫中， 给予特异性药物压力后，就可以从一个混合的转基因群体中筛选出具相关药物抗性的虫体，再通过提取质粒可很容易地获得与抗性相关的基因。此外，还可以将可能与药物抗性有关的基因或等位基因从抗性株转染至敏感株，以研究这些基因的作用。恶性疟原虫的氯哇抗性(chloroquine-resistant， CQR)决定区是染色体7的一个36 kb片段，包括cg2和cgl两个基因， 其内含有与CQR表现型相关的多态性。Fidock等[37]用氯哇敏感株的cg2和cgl序列替代氯哇抗性虫株的相应序列， 经药物检测表明经修饰的氯哇抗性株在CQR的程度上没有改变， 从而提供了反对这一假说的证据。

疟原虫转染技术在基因功能研究方面的应用主要是利用活细胞基因组DNA可与外源性DNA同源序列重组的性质，对预先选择的目的基因进行定点修饰以达到改变基因组某一特定基因的目的。在疟原虫基因敲除研究中， 疟原虫除蚊期的一些阶段外，其余都是单倍体， 某个基因的缺失或插入失活极易产生功能敲除的突变体， 从而分析该基因所编码蛋白的功能。Sultan等[38]构建了血小板反应素/血小板凝血酶敏感蛋白相关未名蛋白(thrombospondin related anonymous protein， TRAP)基因敲除的疟原虫突变株，证实TRAP蛋白对疟原虫子孢子侵入蚊唾液腺的分泌细胞以及宿主的肝细胞具有重要作用，同时在子孢子体外的滑行运动力也起到关键作用。Crabb等[39]构建了结节相关的富组氨酸蛋白(knob associated histidine-rich protein，KAHRP)的恶性疟原虫突变株，这是恶性疟原虫首次被敲除的基因。KAHRP呈现在被原虫寄生的红细胞表面的结节中，敲除KAHRP后， 恶性疟原虫失去形成结节的能力，恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1， PfEMP1)的定位也有改变， 表明KAHRP在结节的形成、PfEMP 1的组织及细胞黏附中具有重要地位。Triglia等[40]对恶性疟原虫中裂殖子表面蛋白1 (merozoite surface protein 1， MSP1)和顶膜抗原蛋白 1(apical membrane antigen 1， AMA-1)进行基因敲除， 敲除恶性疟原虫的MSP1基因或AMA-1基因后原虫不能成活，表明MSP1和AMA-1是完成原虫生活史所必需的。Baldi等[41]利用基因转染技术破坏了红内期恶性疟原虫的棒状体相关蛋白(rhoptry-associated protein 1，RAPI)基因，产生表达缩短的RAP1的恶性疟原虫突变株。结果表明在突变株中RAP1和RAP2的位置发生变化，RAP2没有被运输到棒状体，而是位于与内质网内腔相关的一个腔室内，从而表明RAP2定位到棒状体时需要RAP1，这一结果支持棒状体的生物来源部分依赖于虫体的分泌途径的假说。

减毒活疟原虫疫苗可诱发机体有效的抗体免疫反应，但由于其有致病的可能性而不能作为疫苗。通过利用基因转染技术敲除与疟原虫致病有关的某些基因，同时保留与疟原虫增殖能力和免疫原性有关的基因，从而保证减毒活疟原虫疫苗的安全性，为发展减毒活疟原虫疫苗提供了一个新的方法。疟原虫转基因技术对各种侯选疫苗抗原进行细致的分析必然促进疟疾疫苗的研制，转基因虫株也可以用来研究潜在的药物作用机制和相关抗性研究。

3.2 CRISPR/Cas9系统在恶性疟原虫研究中的应用

CRISP/Cas9系统是一种新的可对靶基因组进行定向修饰的系统，该系统为开发更简易高效基因定点修饰技术提供了崭新的平台。一个典型的CRISPR/Cas9基因座由一个编码Cas9蛋白的操纵子以及重复间隔序列组成， 重复间隔序列由多个相同的重复序列及其间隔序列组成，间隔序列可以特异性地识别外源核酸片段[42]。近几年来， CRISPR/Cas9系统在疟原虫基因组的编辑中得到成功利用，提高了寄生虫基因组的编辑效率，并在疟原虫的基因功能分析、药物靶点和抗药性研究、疫苗候选分子筛选等工作上得到了应用。

Sollelis等[43]编辑恶性疟原虫基因获得无标记的、单核苷酸置换的突变体，并利用线性质粒破坏外源性位点egfp。Zhang等[44]破坏了恶性疟原虫染色体2的kahrp位点和染色体7的eba-175位点，成功率达50%以上。Wagner等[45]指出，利用CRISPR基因组编辑技术，能够在大约一周左右的时间内，以高达100%的成功率，敲掉一个恶性疟原虫的基因，可以更快速进行基因分析并推进新药物的开发。Kuang等[46]利用CRISPR/Cas9方法对恶性疟原虫内源基因进行标签和定点突变修饰，成功高效构建酪蛋白激酶II (casein kinase II， CK2 ) 的两个亚基蛋白(CK2β1，CK2α)以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine- threonine kinase， STK) 3个重组虫株，为进一步在基因水平研究恶性疟原虫奠定了基础。总之，CRISPR/Cas9 系统已经通过单基因敲除、外源基因插入、基因标记、多基因敲除、大片段敲除等功能成功编辑疟原虫的基因，并大大缩短实验周期，增加了靶向位点，扩展了反向遗传学的应用，这些都充分表明CRISPR/Cas9系统可以提高疟原虫的基因编辑效率。

疟原虫药物抗性机制研究中发现青蒿素抗性虫株， 由于缺乏有效的基因编辑手段， 导致相关抗性基因研究进展缓慢。Ariey等[47]报道c580y突变和疟原虫青蒿素抗性有关。Ghorbal等[48]利用CRISPR/Ca9系统在c580y位点引入突变， 观察到c580y突变体生存率提高了13.5%， 验证了Ariey等的结论; 使用该系统分别靶向kahrp和orc1位点， 证实2个基因分别在疟原虫黏附宿主红细胞和基因沉默中发挥重要作用。Ng等[49]利用该系统靶向恶性疟原虫的pfmdr1位点， 观察到处于无性生殖期和配子体的疟原虫突变体对哌嗪类化合物ACT-451840产生抗性，但对临床常见的苯芴醇、甲氟喹、奎宁和阿莫地喹等与青蒿素配合使用的药物灵敏度增加， 对突变体进行基因组测序， 观察到pfmdr1位点具有单核苷酸多态性。这些结果表明， CRISPR/Ca9系统对发现青蒿素抗性相关基因和评估药物的疗效具有重要作用。

4 结语

目前， 许多重要的疫苗候选抗原己经确定， 恶性疟原虫疫苗的研究也取得了很多进展，但仍面临着许多困难，其中最大困难之一就是缺乏廉价有效的动物模型。许多恶性疟原虫疫苗在体外抑制实验或在小鼠和兔子等动物实验中能够显著抑制恶性疟原虫生长， 取得良好的免疫保护效果， 但由于遗传背景的巨大差异、抗原分子体内加工和递呈的不同、人群MHC II类分子的限制性等影响， 在人体实验中往往无法达到预期的免疫保护作用。在高等的灵长类动物中，黑猩猩和南美洲夜猴能感染恶性疟原虫， 可作疫苗评价的动物模型。但黑猩猩濒临灭绝，来源稀缺且饲养价格昂贵。而南美洲夜猴并非是恶性疟原虫的天然宿主， 且来源非常有限，价格昂贵。因此， 寻找适宜的小动物模型进行疟疾疫苗研发或药物筛选十分必要。疟原虫转基因技术的出现和应用，为解决这一问题提供了一种方法和思路。

基因敲除技术主要应用于动物模型的建立， 而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤， 不仅流程繁琐、对技术的要求很高， 而且费用大， 耗时较长， 成功率受到多方面因素的影响。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。随着表观遗传学、转基因技术和CRISPR/Cas9系统的快速发展，可以将实验时间缩短到半年以内，甚至更短，研究人员应用新的技术手段对恶性疟原虫进行深入研究。可预见转基因动物、基因敲出/敲入及CRISPR/Cas9技术将是未来恶性疟原虫动物模型研究的热点。