胰腺癌消融术后免疫反应的变化

仝 昊，陈艳军，程冰冰，胡水全综述，李晓勇审校

(郑州大学第五附属医院肝胆胰腺外科，郑州 450052)

胰腺癌恶性程度极高，外科手术是胰腺癌的主要治疗手段，但早期难以发现，约45%的患者在初诊时已经发生远处转移，仅不到20%的患者尚有手术机会，另有40%的患者发展为局部进展期胰腺癌 (locally advanced pancreatic cancer；LAPC),虽无远处转移，但因肿瘤存在局部广泛浸润，伴有严重的血管侵犯，无法行根治性切除[1]。对于无法根治性切除的患者，治疗手段主要有放疗、化疗和局部治疗。局部治疗主要有动脉灌注化疗、区域放疗和射频消融(RFA)、微波消融及冷冻消融等常规的消融方法，以及不可逆电穿孔消融术。放化疗可以提供短期疾病控制，但目前大多数化疗方案并未显著延长生存期。对于晚期胰腺癌，以改善疾病相关症状、延长生存期为主要目的，动脉灌注化疗、125I粒子植入、射频和微波治疗等可取得较好的治疗效果。对于LAPC的治疗，以消融术为主。常规消融方法利用温度变化使目标区域的细胞发生坏死，但因热沉效应使靶区周围的温度改变不足以杀死边缘肿瘤细胞，从而导致肿瘤局部消融不全、复发率增高，同时对胆管、胰管、血管等造成不可逆损伤，因此术后并发症发生率较高。不同于传统的消融技术，不可逆电穿孔消融(IRE)利用高压、高频脉冲电流产生的电场，使细胞膜出现不可逆的纳米孔道，从而导致细胞内稳态失衡，诱发凋亡，且短期内安全性及有效性已得到临床证实[2]。LAPC消融术后患者生存期显著延长，可能与消融术后机体抗肿瘤免疫激活有关[3]。本文将对各种消融术后机体的抗肿瘤免疫、免疫反应变化逐一叙述。

1 免疫系统

正常人体免疫系统的功能包括免疫防御、免疫稳定和免疫监视，免疫应答过程中有多种免疫细胞参与，免疫反应主要包括体液免疫和细胞免疫反应，细胞免疫主要参与机体的抗肿瘤免疫反应。免疫细胞功能各异，T淋巴细胞拥有免疫监视、免疫调节的功能，自然杀伤细胞(NK细胞)除上述功能外，还可直接杀伤肿瘤细胞，组成机体的抗肿瘤免疫屏障。正常情况下，周围组织中T淋巴细胞及其亚群的数目相对稳定，当免疫调节功能紊乱时通常表现为T淋巴细胞总数或CD4+/CD8+细胞比值异常，此时易发生肿瘤或自身免疫性疾病。CD4+T淋巴细胞即辅助性T淋巴细胞(Th细胞)，肿瘤细胞分泌的可溶性抗原可被CD4+T淋巴细胞识别，刺激Th细胞分化为不同亚型的T淋巴细胞，进一步激活巨噬细胞、NK细胞、B淋巴细胞和特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，产生抗肿瘤免疫反应。除上述功能外，Th细胞分泌的细胞因子同样参与调节抗肿瘤免疫反应，如Th1细胞可分泌白细胞介素(IL)- 2、干扰素(IFN)- γ，通过促进CTL的增生、激活NK细胞和巨噬细胞，辅助抗体生成，参与细胞免疫以增强机体抗肿瘤效应；Th2细胞主要分泌IL- 4、IL- 5及IL- 10等细胞因子，可刺激B淋巴细胞增殖并产生IgG、IgE抗体，参与体液免疫。CD8+T淋巴细胞按功能可分为抑制性T淋巴细胞(Ts细胞)和杀伤性T淋巴细胞，前者既可通过分泌抑制因子(TsF)作用于靶细胞如Th细胞和B淋巴细胞，又可直接诱导抗原呈递细胞表达抑制性受体，从而对免疫应答活化阶段起到抑制作用。多种免疫抑制因子(TDSF)于肿瘤细胞扩散转移时分泌增多，可使CD3和CD4+细胞减少，CD8+细胞增加，因而CD4+/CD8+细胞比值随之降低[4]。TDSF还可导致NK细胞活性降低，伴随着杀伤肿瘤细胞的过程，NK细胞被大量消耗，以及NK细胞在血液循环中再分布等原因，NK细胞数量也相对减少，机体的免疫功能严重受损，为肿瘤的生长、转移创造条件。而肿瘤的凋亡则与B淋巴细胞瘤- 2(Bcl- 2)蛋白及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶- 3(Caspase- 3)有直接关系。Bcl- 2蛋白是Bcl- 2原癌基因的编码产物，是细胞存活促进因子，通过阻断细胞色素C从线粒体释放入细胞质的过程，抑制细胞的凋亡，Bcl- 2蛋白的降低可促发肿瘤细胞凋亡[5]；同时促进Caspase- 3这一重要促凋亡因子的表达，进而导致肿瘤细胞发生不可逆性凋亡。肿瘤坏死因子- α(TNF- α)是热休克蛋白(HSP)家族中最保守、最重要的一族，TNF- α和HSP70在肿瘤免疫中发挥重要作用，能诱导和增强机体抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长[6]。晚期癌症患者缺乏单核细胞和Ⅰ型免疫反应，患者外周血IL- 2、IL- 10、IL- 12、IFN- c和TNF- α的表达水平明显降低，热消融后机体免疫功能发生改变，促炎细胞因子如IL- 1、IL- 6、IL- 8、IL- 18和TNF- α增加数小时至数天[7- 9]，其中IL- 1和IL- 18已知可促进1型辅助性T淋巴细胞(Th1)应答，促进树突状细胞(DC)和CTL的激活；IL- 6是T淋巴细胞增殖和生存的关键，在T淋巴细胞向肿瘤部位运输中起着不可或缺的作用。但是，这种细胞因子也有负面影响，IL- 6通过阻碍DC的发展和成熟，增加骨髓来源的抑制细胞和抑制Th1细胞的极化来抑制抗肿瘤免疫应答。此外，IL- 6激活酪氨酸激酶/转录激活因子- 3(JAK/STAT3)信号通路，从而增加肿瘤细胞增殖，支持肿瘤细胞存活并增强转移潜能，与肿瘤的发生、发展有着密切的联系[10]。因此，IL- 6通常被认为是癌症患者预后不良的指标。由此可见，热消融术后机体的抗肿瘤免疫反应中免疫激活与免疫抑制效应共存，如果能够给予适当的干预措施，患者的生存期将有望明显延长。

2 胰腺癌治疗方法

2.1高强度聚焦超声(HIFU) HIFU是近年来应用于肿瘤治疗的一种新手段，其利用高声强的超声波聚焦于肿瘤组织并产生高热，使肿瘤细胞发生凝固性坏死，释放大量肿瘤相关抗原，可上调HSP及IL- 1表达，趋化相关免疫细胞，诱导特异性抗肿瘤免疫。HIFU治疗胰腺癌后可明显缓解患者疼痛，延长患者生存期[11]，有效抑制肿瘤生长，减轻肿瘤负荷，且并发症少[12]，引起胰腺癌细胞血行播散风险较手术更低[13]。经HIFU同步吉西他滨化疗联合DC- 细胞因子诱导的杀伤细胞免疫疗法(DC- CIK)治疗中晚期胰腺癌后，患者CD8+T淋巴细胞较治疗前下降，而CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+/CD8+细胞比值升高，机体抗肿瘤免疫反应明显被激活，有效减少了肿瘤复发和转移，中位无进展生存达8个月[14]。

2.2微波消融 微波消融主要用于晚期胰腺癌的治疗，通过微波带动身体极性分子运动产热，肿瘤组织经高温固化后，固化点处癌细胞完全凝固坏死，高温使坏死组织产生HSP，刺激机体的免疫系统使抗肿瘤免疫效应增强，抑制残余的肿瘤细胞扩散。术中直视下直接穿刺体尾部胰腺癌行微波治疗，未出现明显肠漏、胆漏、大出血等不良反应，胰漏发生率低，且患者的生存质量有明显的改善，术后生存期明显延长[15]。CT引导下经皮高频微波治疗LAPC，可降低微波消融的侵袭性，术后并发症发生率低，从而在保持安全性和功效的同时提高患者生活质量。术后3个月的随访中，肿瘤局部进展率为1/10，表明微波消融是一种安全、有效的治疗LAPC的方法，术后可以延长生存期，明显改善患者的生存质量[16]。

2.3氩氦刀冷冻消融 氩氦刀冷冻消融主要通过急速地在针尖释放氩气、氦气使冷冻刀周围一定范围内的肿瘤细胞在极短时间内经过降温、升温处理而坏死或诱发其凋亡，同时微血管内皮细胞被破坏，内皮下胶原暴露及血小板的聚集为微循环血栓形成创造了条件，促进了肿瘤的坏死。释放氩气时迅速在冷冻刀周围形成冰球，由于冰球内温度的下降速度差异，消融的中心区表现为液化性坏死，而周围则表现为凋亡。低温免疫疗法能够明显增加转移性胰腺癌的中位生存期[17]，通过检测术后外周血CD4+、CD4+/CD8+细胞比值、NK细胞的变化及TNF- α、糖类抗原(CA)199、CA125、癌胚抗原(CEA)的血清水平，可预测及评估患者的疗效与预后。研究发现，术后患者血清CA199及CEA水平较术前明显降低，疼痛得到有效缓解，从而提高患者术后生活质量[18]。术后患者生存期的明显延长，可能与胰腺癌患者的细胞免疫功能增强有关。大量的临床及实验研究表明肿瘤冷冻后所致的抗肿瘤免疫效应很强，但对机体产生的抗肿瘤免疫效应既可以是免疫刺激亦可以是免疫抑制，单靠冷冻消融可能不足以产生临床相关的有效免疫应答，冷冻消融最好与免疫佐剂结合用于临床治疗[19]。冷冻消融联合低剂量环磷酰胺可通过减少Treg细胞来增强抵抗肿瘤复发的能力，延长生存期，疗效显著[20]。

2.4RFA RFA是在术中直视或CT、超声的引导下将电极针插入靶组织，通过射频发生器发出射频波，导致病灶组织局部高温变性、凝固坏死，从而杀灭肿瘤细胞。RFA的体积大小与组织内热传导、局部血流情况、电极针类型有关，普通电极针最大毁损直径可达16 mm。保持适当的消融温度，并与重要结构保持适当的距离，将使胰腺癌的RFA治疗更具有安全性及有效性。已有研究表明，RFA辅助治疗晚期肝癌可诱发机体产生细胞及体液免疫反应，表现为CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比值及NK细胞水平明显高于治疗前，而CD8+水平明显低于治疗前，IgA、IgG及IgM水平均明显高于治疗前[21]。胰腺癌RFA术后抗肿瘤免疫反应的激活与HSP70表达增加密切相关，HSP因所处环境的不同而功能各异，位于细胞内的HSP可使细胞凋亡过程受到抑制，保护组织免受损伤；而分泌至细胞外的HSP通过参与多种抗原免疫反应，促进肿瘤特异性抗原的表达，诱导特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞，从而增强机体抗肿瘤免疫反应，延长患者的无进展生存期[22]。RFA术后CD4+、CD8+和效应型记忆T淋巴细胞(TEM)表达首先增多，表明适应性反应的激活，免疫抑制T- Reg细胞水平保持稳定，呈递肿瘤相关抗原的骨髓DC表达较晚，循环IL- 6术后短暂升高后又将至正常水平，与假定的抗肿瘤作用一致。RFA并没有显著调节如CCL- 5、基质细胞衍生因子1(SDF1)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子- β(TGF- β)和TNF- α等通过维持癌症血管生成和促进肿瘤相关炎症以促进肿瘤生长必需的趋化因子[23]。越来越多的证据表明，热消融可诱导自发的远距离肿瘤消退，即远隔效应，远隔效应可能依赖于抗肿瘤免疫应答的激活[3]。然而，热消融诱导的这种反应通常被认为是微弱的，并且很少诱导远处肿瘤消退。如果与合适的免疫调节剂组合，热消融可以诱导治疗有效的全身性抗肿瘤免疫应答[24- 25]。

2.5IRE IRE俗称“纳米刀”，通过在肿瘤细胞两侧释放千伏级高压的直流电，以电脉冲方式产生强力的电场，使细胞膜上产生永久性的纳米孔道，细胞内液外流，进而程序性地促进肿瘤细胞凋亡，达到消融肿瘤组织的目的。相较于通过改变温度达到治疗效果的传统消融术，“纳米刀”对血管、胆管、胰管等重要管道结构损伤较小，具有更高的安全性，术后胰漏、出血、胆漏等并发症发生率较其他消融方式明显降低，近期疗效肯定[26- 27]。一项经皮图像引导下LAPC的IRE治疗研究显示，肿瘤大小以3 cm为临界值，肿瘤越小，术后患者生存期越长[28]。“纳米刀”治疗兔胰腺移植瘤的实验表明，消融区边界清晰，细胞核核固缩、碎裂、蓝染；肿瘤血管变性坏死、血栓形成，内见红细胞碎裂物沉积，但血管腔结构完整，纳米刀治疗组血浆水平及术区边缘HSP70表达水平均较模型对照组明显升高，由此得出“纳米刀”可能通过诱导细胞凋亡产生特异的抗肿瘤免疫效应及抑制血管生成来抑制兔胰腺移植瘤的生长，且在激发机体肿瘤免疫和保护周围重要脏器上有一定的优势[29]。已有临床试验将“纳米刀”与免疫激动剂联合治疗胰腺癌，短期临床疗效显著，同种异体NK细胞免疫治疗联合IRE具有协同作用，不仅能增强患者的免疫功能，还能降低CA19- 9和CA242的表达，短期疗效显著，患者的生活质量得到显著提高[30]。

总之，无论是传统的消融术还是“纳米刀”消融术，都可以作为一种安全、有效的不可切除胰腺癌的治疗方式，消融术后患者生存期的延长，与抗肿瘤免疫反应的激活有关，但其作用微弱，通过与免疫激动剂联合作用，使得抗肿瘤效应增强，短期疗效显著，为延长患者生存期提供了有效的临床研究证据。而“纳米刀”作为LAPC一种新的治疗方法，在保护血管、胰管、胆管等重要结构方面有着不可忽视的优势，相比于其他消融方式更适合不可切除胰腺癌的治疗，其短期安全性及有效性更胜一筹，术后并发症明显减少，有效提高了患者的生活质量，且在激活机体产生抗肿瘤免疫反应方面明显优于其他治疗方式。伴随着分子生物学、肿瘤免疫学的飞速发展，细胞免疫治疗也有了质的飞跃，使免疫治疗成为胰腺癌继手术治疗、放疗、化疗之后的重要辅助治疗方法。将“纳米刀”与免疫治疗结合应用于LAPC的治疗已初见成效，相信在不久的将来，“纳米刀”联合免疫治疗将在不可切除胰腺癌的治疗中发挥更大的作用。