小檗胺联合热疗对人胃癌顺铂耐药细胞增殖的影响*

陈 妮, 赵 梅, 陈 玲, 韩鹏定

1.海南医学院第二附属医院 药学部 (海南 570311)；2.海南省第三人民医院 药学部(海南 572000)

胃癌是中国发病率较高的胃肠道恶性肿瘤[1]。尽管胃癌已经获得了有效的治疗方法，包括胃镜检查、全身化疗和靶向药物治疗、手术切除等，但胃癌的预后仍然较差，数据[2]统计，胃癌患者的5年总生存率低于30%。小檗胺是来自小檗属与黄连属植物中的一种天然化合物，研究[3-7]发现，小檗胺对多种不同的癌症有明显的抗肿瘤作用。热疗是将肿瘤区域利用合适的热源加热至41～43 ℃并保持一定时间，从而达到抑制肿瘤作用的一种方法。在临床上，单纯热疗对肿瘤的抑制作用效果不明显。最新研究[8]发现，热疗与抗肿瘤药物联合使用，可促进抗肿瘤药物的抗肿瘤效果。本研究通过探讨小檗胺联合热疗对人胃癌顺铂耐药细胞(SGC-7901/DPP)增殖的影响， 研究其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

胎牛血清和达尔贝科极限必需培养液(dulbecco minimum essential medium,DMEM)培养液购于Thermo Fisher Scientific公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂以及小檗胺化合物购于Sigma公司；SGC-7901/DPP细胞株购买于上海中科院细胞库；蛋白质印迹技术(Western blot)实验相关抗体购于Abcam公司。膜连蛋白 V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡试剂盒购于北京碧云天生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

SGC-7901/DPP细胞培养于DMEM培养液培养(培养液含有10%的胎牛血清、0.1 U/L青霉素和100 g/L链霉素)；培养条件为：细胞培养箱内(37 ℃，5% CO2)常规培养。

1.3 细胞处理

细胞根据不同的处理方式分为：1)对照组：SGC-7901/DPP细胞于培养箱中进行常规培养；2)热疗组: 利用恒温43 ℃处理SGC-7901/DPP细胞48 h；3)小檗胺组：利用小檗胺(16 mg/L) 处理SGC-7901/DPP细胞48 h； 4)小檗胺联合热疗组：小檗胺(16 mg/L)联合恒温43 ℃处理SGC-7901/DPP细胞48 h。

1.4 MTT实验检测细胞增殖能力

SCG-7901/DPP细胞(1×104个/孔)于96孔板中接种， 培养24 h 后用不同浓度的小檗胺(0～64 mg/L)或者按照1.3分组处理细胞，于48 h后在96孔板中每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h 后于每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)， 在570 nm 波长处测定吸光度A值， 抑制率/%=(570 nmA值：对照组-570 nmA值：实验组)/570 nmA值：对照组×100%。

1.5 细胞集落形成试验检测细胞生长能力

细胞按照1.3分组处理48 h后，SGC-7901/DPP细胞于6 孔培养板接种，连续培养10 d，每隔3 d更换1 次培养基，每组3个复孔。于10 d后， 将细胞利用75%乙醇固定，然后利用0.5%结晶紫染色。显微镜下观察拍照，并计算集落数量。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率

细胞按照1.3分组处理48 h后， 用PBS洗涤SGC-7901/DPP细胞，将细胞利用70% 冷乙醇固定后，与RNA 酶反应过夜，然后将反应的细胞与碘化丙啶染液混匀后， 细胞分析采用流式细胞仪，激发波长为488 nm，细胞凋亡率采用Modfit LT 2.0 软件分析。

1.7 Western blot检测细胞中蛋白水平

细胞按照1.3分组处理48 h后， 利用含有蛋白酶抑制剂(RIPA)缓冲液裂解SGC-7901/DPP细胞进行蛋白的提取。 蛋白浓度的测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行。 将等量总蛋白(20 g)利用10% SDS-PAGE凝胶电泳， 然后利用半干法将电泳蛋白转移至PVDF膜，PVDF膜于室温利用TBST溶液(含有5%脱脂奶粉) 封闭1 h，TBST 洗涤，然后与不同的一抗于4 ℃冰箱孵育过夜。 将冰箱孵育过夜的PVDF膜利用TBST洗涤3 次之后，与辣根果氧化物酶标记的二抗于室温孵育1 h，利用ECL试剂盒曝光显影。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 小檗胺对SGC-7901/DPP细胞的增殖影响

利用不同浓度的小檗胺(0～64 mg/L)处理SGC-7901/DPP细胞48 h 后， MTT实验检测SGC-7901/DPP 细胞活性，发现小檗胺在16 mg/L时，对SGC-7901/DPP 细胞增殖抑制达到了(21.3±3.1)%，随着浓度的升高，小檗胺对SGC-7901/DPP细胞增殖的抑制没有明显提高，抑制率分别为 (22.5±5.6)%和(23.5±4.5)% 。因此本研究选择了16 mg/L 小檗胺作为后续的联合热疗实验(表1)。

表1 小檗胺对SGC-7901/DPP细胞增殖的影响

2.2 小檗胺联合热疗对SGC-7901/DPP细胞增殖、凋亡的影响

MTT实验结果显示，与对照组相比，单独热疗处理或者单独小檗胺 (16 mg/L)处理可抑制SGC-7901/DPP细胞增殖，抑制率分别为(17.2 ± 4.5)%和(23.3 ± 6.0)%；小檗胺联合热疗处理SGC-7901/DPP细胞可进一步抑制细胞增殖，抑制率为(70.9 ± 7.5)%，与单独热疗组或者小檗胺组相比差异有统计学意义(P<0.01)。集落形成实验结果显示，与对照组相比，单独热疗处理或者单独小檗胺 (16 mg/L)处理可以抑制SGC-7901/DPP细胞的集落形成数量，抑制率分别为30.3%和37.0%；小檗胺联合热疗处理SGC-7901/DPP细胞可进一步抑制细胞的集落形成数量，抑制率为72.6%，与单独热疗组或小檗胺组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞技术实验结果显示，与对照组相比，单独热疗处理或者单独小檗胺 (16 mg/L)处理可以增加SGC-7901/DPP细胞的凋亡比例，凋亡率增加分别为(21.5±4.5)%和(23.9±5.7)%；与单独热疗组或者小檗胺组相比，小檗胺联合热疗处理SGC-7901/DPP细胞可以进一步增加SGC-7901/DPP细胞的凋亡比例(P<0.05)(表2)。

表2 小檗胺联合热疗对SGC-7901/DPP细胞增殖、凋亡的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与热疗组比较，#P<0.05，##P<0.01；与小檗胺组比较，&P<0.05,&&P<0.01

2.3 小檗胺联合热疗影响SGC-7901/DPP细胞凋亡相关蛋白表达水平

小檗胺联合热疗对SGC-7901/DPP细胞凋亡相关蛋白的影响利用Western blot检测，与对照组相比，单独热疗组和小檗胺组(16 mg/L)处理能够降低Bcl-2的蛋白水平，同时提高Bax，cleaved caspase-3以及cleaved caspase-9的蛋白水平(P<0.05)。与单独热疗组或者小檗胺组(16 mg/L)相比，小檗胺联合热疗组中 Bcl-2的蛋白水平降低，Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 的蛋白水平明显提高(P<0.05)(图1)。

注：A: Western blot 检测各组SGC-7901/DPP细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 蛋白的表达；B: 各组SGC-7901/DPP细胞中Bcl-2蛋白表达水平的统计分析；C: 各组SGC-7901/DPP细胞中Bax蛋白表达水平的统计分析；D: 各组SGC-7901/DPP细胞中cleaved caspase-3蛋白表达水平的统计分析；E：各组SGC-7901/DPP细胞中cleaved caspase-9蛋白表达水平的统计分析；1：对照组；2：热疗组；3：小檗胺组；4：小檗胺联合热疗组；与对照组比较，*P<0.05；与热疗组比较，#P<0.05；与小檗胺组比较，&P<0.05

2.4 小檗胺联合热疗抑制SGC-7901/DPP细胞耐药相关蛋白的表达水平

小檗胺联合热疗对SGC-7901/DPP细胞凋亡相关蛋白的影响利用Western blot检测，与对照组相比，单独热疗组和小檗胺组(16 mg/L)处理能够明显降低多药耐药基因1(multidrug resistance protein 1， MDR1)以及多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)的蛋白水平(P<0.05)。与单独热疗组或小檗胺组(16 mg/L)相比，小檗胺联合热疗组的MDR1以及MRP1蛋白水平明显降低(P<0.05)(图2)。

图2 小檗胺联合热疗抑制SGC-7901/DPP细胞耐药相关蛋白的表达水平

注：A: Western blot 检测各组SGC-7901/DPP细胞中MDR1和MRP1蛋白的表达；B: 各组SGC-7901/DPP细胞中MDR1蛋白表达水平的统计分析；C: 各组SGC-7901/DPP细胞中MRP1蛋白表达水平的统计分析；1：对照组；2：热疗组；3：小檗胺组；4：小檗胺联合热疗组；与对照组比较，*P<0.05; 与热疗组比较，#P<0.05；与小檗胺组比较，&P<0.05

3 讨论

胃癌治疗的方法主要包括手术治疗、放射治疗和化疗。 多药耐药(multidrug resistance，MDR)的发展大大降低了化疗的疗效， 减轻MDR的发展可以恢复癌细胞对化疗的敏感性。 研究[9]发现，MDR相关蛋白的表达在MDR的发生发展中起着至关重要的作用。在临床上，热疗作为一种辅助治疗肿瘤的手段联合化疗已经收到越来越多的关注，并且已在相关肿瘤治疗中获得了应用[10]。小檗胺具有免疫保护功能和活性，如刺激正常造血功能，具有抗炎和抗心律失常等作用[11-13]。虽然有研究[3-7]表明，小檗胺对不同类型的肿瘤有抑制作用，但其对胃癌的作用尚不明确，机制尚不清楚。本研究发现，小檗胺联合热疗可以有效抑制SGC-7901/DPP细胞的增殖，增加SGC-7901/DPP细胞凋亡，同时抑制MDR1和MRP1的蛋白水平，比单独热疗或单独使用小檗胺更有效。

小檗胺可以抑制不同类型肿瘤细胞的增殖，这种抑制作用可能是通过触发凋亡途径发挥其抗肿瘤活性，并调节参与癌症进展的信号通路。凋亡信号传导途径的异常与癌症发生有着紧密联系。许多抗癌化合物通过激活凋亡途径发挥其抗癌作用。在胰腺癌中，小檗碱能够增加胰腺癌细胞中的Bax/Bcl-2比例，增强caspase-3和caspase-9的蛋白水平，从而诱导胰腺癌细胞中的细胞凋亡[4]。Zhang等[5]发现，小檗胺能够提高促凋亡Bax蛋白的水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达，从而导骨髓瘤细胞凋亡。 Wang等[14]研究发现，小檗胺能增加Fas、 p53、caspase-3和caspase-8、caspase-9蛋白的表达，从而促进HepG2细胞凋亡。最新研究[5]发现，小檗胺能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制卵巢癌细胞的增殖，并促进其凋亡。Zhang等[7]研究也发现，小檗胺通过p53依赖机制促进结肠癌细胞的凋亡。本研究中，小檗胺联合热疗能够促进SGC-7901/DPP细胞的凋亡，这种促进凋亡作用可能与Bcl-2蛋白水平的降低，以及caspase-3、caspase-9和Bax蛋白水平升高有关。

MDR是治疗癌症的主要障碍，包括主要导致化疗失败的胃癌治疗。MDR1基因编码属于ATP结合盒转运蛋白超家族的P-糖蛋白(P-gp)。 P-gp能够将化疗药物转运出细胞，导致药物积聚下降，进而导致MDR[15-16]。 MRP1也属于ATP结合盒转运蛋白超家族，MRP1导致MDR的作用机制与MDR1相似[17]。本研究中，小檗胺联合热疗处理，可降低SGC-7901/DPP细胞的MDR1以及MRP1蛋白水平，提示小檗胺联合热疗抑制SGC-7901/DPP细胞增殖可能与抑制MDR1以及MRP1蛋白水平有关。

综上所述，小檗胺联合热疗对SGC-7901/DPP的增殖抑制作用可能通过调控凋亡相关蛋白，促进SGC-7901/DPP凋亡以及抑制MDR1和MRP1蛋白水平有关。未来将在以下几个方面开展研究工作：探索小檗胺联合热疗能否降低SGC-7901/DPP的耐药性；探讨小檗胺联合热疗对SGC-7901/DPP耐药性的相关分子信号通路的影响；进一步研究小檗胺联合热疗对其他类型的耐药性癌细胞增殖的影响；利用动物肿瘤模型进一步确认小檗胺联合热疗的体内抗肿瘤活性。