从专利分析角度看口蹄疫表位疫苗

余 璨

(国家知识产权局专利局专利审查协作四川中心，四川 成都 610213)

1 引言

FMD是由FMDV引起偶蹄动物的一种急性、烈性传染病，以直接接触方式传染，主要危害猪、牛、羊等家畜和其他家养、野生偶蹄动物，其传染速度极快易引发大规模流行，对畜牧业的危害极大。引起FMD的FMDV是一种小核糖核酸病毒，其共有7种不同的血清型以及80种以上的亚型，各型间无交叉免疫，病后康复或免疫动物仍存在感染其它血清型病毒而发病的可能[1-4]。近年来，虽然北美洲、大洋洲和大部分欧洲等保持了无FMD疫情状态，但是亚洲和非洲FMD流行仍然频繁甚至疫情严重。随着我国畜禽养殖规模及密度不断扩大，FMD防治的重要性与迫切性愈加凸出。

疫苗免疫是防控FMD的主要手段，纵观FMD疫苗的研发进程，其主要经历弱毒疫苗、灭活疫苗、新型疫苗等阶段。近年来，随着分子生物学的发展以及新免疫理论的提出，新型疫苗得到了发展并成为了疫苗研究的热点和重点。在目前的新型疫苗中，以抗原表位为基础制备的表位疫苗由于其针对性强、特异性高、广谱性强，安全可靠等优点而脱颖而出。近年来，FMD表位疫苗的专利技术取得了很大进步，同时专利信息是获取该领域最新成果、产业现状的重要来源。因此，本文从专利分析角度对FMD表位疫苗的技术研究进行总结，为安全有效的FMD疫苗的研制以及其他疾病的表位疫苗研究提供参考。

2 FMDV相关表位

早在1981年，Kupper等、Boothroyd等、Kleid等先后报道了具有免疫活性的FMDV VP1基因[5]。1982年，Pfaff鉴定到FMDV O型VP1中的第144-159位氨基酸序列为一个主要的抗体结合位点[6]，同年，Bittle等发现了处于FMDV O型Kaufbeuren毒株的VP1的第141-160、200-213位氨基酸序列的重要表位，并且进一步验证了其能产生血清型特异型病毒中和抗体[7]。以此为开端，FMD表位疫苗研究的序幕正式拉开，研究者们从表位确定与筛选、表位构建等方面对表位疫苗进行了探索和研究，极大丰富了FMD表位疫苗相关技术，FMD表位疫苗发展迅速。

2.1 表位类型

表位是指蛋白抗原可产生免疫性的最小区域[8]，具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够被其识别的部位，又称抗原决定簇。通常情况下，免疫细胞仅识别抗原上的表位，因而抗体的特异性通常理解是针对表位而非完整的抗原分子而言的。表位通常是较短的氨基酸片段，并且根据与抗原受体结合的不同，可将表位分为B细胞抗原表位和 T细胞抗原表位；按表位结构不同分为线型表位和构象型抗原表位。线型表位见于T细胞表位和部分B细胞表位，而构象型表位见于B细胞表位。FMDV由衣壳蛋和非结构蛋白构成，FMDV衣壳蛋白由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成，VP1-VP3位于衣壳蛋白的外侧，组成衣壳蛋白亚单位，VP4位于病毒颗粒的内部，衣壳蛋白VP1-VP4基因均参与抗原位点的形成。FMDV 的非结构蛋白是除了衣壳蛋白和它们前体蛋白之外的所有由病毒编码但不参与病毒衣壳组成的蛋白，包括成熟蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D[9]。鉴于FMDV表位类型的缺乏会严重制约表位疫苗的发展，因此，本文整理了目前重要的结构蛋白、非结构蛋白的位点以及类型，如表1所示。

表1 结构蛋白、非结构蛋白重点表位类型表

2.2 表位筛选方式

虽然早在1982年，Bittle和Pfaff等就利用免疫原性多肽确定了位于FMDV结构蛋白VP1中的表位，或者通过生化方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段，并以此间接推测抗原表位分布区域及构成表位的关键氨基酸[10-11]。但是，上述方法存在工作量大、效率低、成本高、难以获得构象表位的缺点。随着噬菌体表面展示技术、计算机技术等的日臻成熟，抗原表位的筛选和鉴定方式取得了很大进步。

2.2.1 噬菌体表面展示技术

CN101597327A、 CN101948510A公开了采用噬菌体表面展示技术对FMDV的抗原表位进行筛选。噬菌体表面展示技术是利用表达的外源肽与噬菌体表面特定蛋白融合并展示于其表面，被展示的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物特性，借以研究多肽的性质、相互识别和作用，并据此从巨大的展示肽库中选择出具有特定功能的多肽[12]。噬菌体表面展示技术用于筛选表位肽具有简便有效、成本低廉的优点，以此设计的表位疫苗可能诱导更为有效的免疫应答。

2.2.2 计算机软件预测与筛选

随着分子生物学、分子免疫学技术与计算机科学技术的交互渗透，以及核酸和蛋白质序列及结构信息的数量增加以及相应数据库的建立，借助于计算机预测抗原表位已成为目前表位筛选的重要方式。CN103897065A公开了采用DNA Star生物软件对抗原表位进行预测。CN101838319A公开了多种表位预测工具，如用于B细胞表位预测的SYFPEITHI、 Bcepred、BepiPred、ABcpred等；用于Th表位预测的mhc2pred、MHCPred、Propred；用于CTL功能表位预测的BIMAS、SYFPEITHI、Predict、EPIPREDICY等。除了上述两种重要的筛选方式外，合成重叠肽、质谱分析、计算机预测与动物实验筛选相结合也被应用于FMDV表位的筛选和鉴定当中。

3 FMD表位疫苗

3.1 表位疫苗的构建

3.1.1 抗原表位的连接模式

由于表位多肽的分子量小，既不足以引起机体的免疫又容易被细胞内的蛋白酶所降解，因此为了克服上述抗原表位单独存在时的缺陷，针对不同的使用目的、生产方式可以选择不同的表位系统来增强抗原表位的免疫原性。

3.1.1.1 表位与载体连接

将表位多肽与较大蛋白载体等进行连接能够得到均一的和结构确定的免疫原。常用的载体涉及绿色荧光蛋白、乙肝病毒核心抗原、β-半乳糖苷酶等。CN1468958A将编码FMDV A型与O型病毒的多表位的核酸序列串联后与绿色荧光蛋白基因串联，使之成为双价多肽疫苗融合基因并通过表达获得双价多肽疫苗蛋白。乙肝核心蛋白基因是具有强免疫源性的蛋白基因，CN1090203A中用FMDV VP1的编码141-160、200-213位氨基酸的基因与乙肝病毒核心抗原基因连接，将重组质粒转入细菌表达后得到融合蛋白。在采用β-半乳糖苷酶的研究中，复旦大学对其进行了深入拓展，CN1408349A中采用了β-半乳糖苷酶或是β-半乳糖苷酶第1位至第583位氨基酸肽段的同源序列作为载体蛋白与FMDV VP1蛋白中具有抗原性的肽段进行连接。CN1986562A将FMDV VP2蛋白第1-33位氨基酸的抗原表位连在载体蛋白半乳糖苷酶C端从而制备得融合蛋白LacZ-B1，该融合蛋白可作为新型FMD基因工程多肽疫苗免疫刺激佐剂，增强动物抗体应答。CN101314036A中考虑到β-半乳糖苷酶全长基因太大会降低抗原表位基因在融合基因中的比例从而对免疫原性造成的影响，将pWR590中β-半乳糖苷酶的590个氨基酸截短310个氨基酸后，以pWR280作为新载体蛋白构建得到抗FMDV基因工程多肽疫苗，比以pWR590为载体构建的多肽疫苗具有更好的免疫效果。

3.1.1.2 抗体化抗原分子

由于将FMDV肽段与诸如β-半乳糖苷酶连接可能产生超敏反应的副作用，因此“抗体化抗原分子”成为了抗原表位的构建的新模式。抗体化抗原分子是针对特异性B或T细胞表位产生免疫应答的免疫原，其通常是将IgG重链恒定区的基因通过增加诸如FMDV表位肽这样的小分子表位的分子量使其完全抗原化，并通过MHC分子与IgG分子Fc端的高效结合促进了靶标抗原的递呈，在增强靶标抗原的免疫原性的同时还能延长靶标抗原的半衰期。CN1408349A、CN108330134A、CN108273054A 等专利申请中均公开了抗体化抗原分子。进一步的，CN101864434A基于激发被免疫动物的T淋巴细胞应答，在现已有的抗体化抗原的分子的基础上，产生了能诱导产生更高水平的中和抗体抗体化抗原与非结构蛋白3D联合使用的疫苗。同时，为实现"一针防多病" CN103897065A针对我国牛O型和Asia1型2个主要血清型的FMDV毒株的主要抗原表位序列，将优势抗原表位串联后与牛IgG重链恒定区串联得到复合多表位重组抗原，并将其与3D蛋白进行混合得到疫苗。此外，CN101721698A还对免疫球蛋白重链恒定区、3D蛋白及其融合蛋白与3D蛋白联合的方式进行了扩展。

3.1.1.3 与其他肽片段连接

将FMDV表位与其他的肽片段进行连接也是FMD表位疫苗的通常构建方式，该种疫苗既能针对FMD又由于引入具有其他功能的肽片段，使得疫苗的功能灵活多样。其他肽片段主要涉及到佐剂分子、T细胞表位等。CN101070348A基于FMDV的主要传播途径是呼吸道传播，故粘膜免疫是其第一防线，基于粘膜免疫的原理，采用了良好的粘膜佐剂分子霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位与O型FMDV VP1的主要抗原表位连接并加入纯化标签His标签最终获得了免疫效果较好的疫苗。T细胞能增强了中和抗体的作用，T细胞表位的引入也是一种常见的疫苗构建方式。T细胞表位通常涉及辅助性T细胞表位、外源T细胞表位以及通用T细胞表位。CN102406929A将辅助性T细胞表位引用于FMD疫苗的制备中。CN101579522A公开了FMDV VP1的B细胞表位与小反刍兽疫病毒上的一段能增强FMDV VP1上优势B细胞表位的强效外源T细胞表位进行连接构建了含辅助性强效外源T细胞表位和FMDV主要抗原表位基因的多肽疫苗。在利用通用T细胞表位方面，CN105399802A中公开了含有通用T细胞表位、A型FMDV主要中和性抗原表位的FMD表位疫苗，随后，CN105777909A为了将表位蛋白分子靶向于树突状细胞表面受体，提高表位蛋白的抗原递呈效率，在CN105399802A的基础上引入了趋化因子从而获得了免疫效果增强的疫苗。

3.1.1.4 活载体表位疫苗

活载体疫苗是将外源基因插入到某些活载体基因内，使其能够高效表达又不影响疫苗株的正常生存与繁殖，同时，在这种疫苗中，抗原表位的构象与致病性病原体抗原的构象相同或非常相似。并且，在病毒类的活载体疫苗中，其还可以部分地模拟病毒攻击的过程，可诱导产生体液免疫、细胞免疫甚至黏膜免疫。CN1827172A公开了以犬II型腺病毒为载体的重组猪Asia 1型FMDV VP1基因腺病毒载体活疫苗，获得的重组病毒具有良好的遗传稳定性，并且可诱导猪产生特异的抗病毒中和抗体。CN102604898A选取兔出血症病毒衣壳蛋白VP60作为展示外源FMDV B细胞表位的载体最终获得了疫苗。

3.1.2 抗原表位的空间结构构建

由于具有游离巯基的半胱氨酸的存在可增加游离的多肽的免疫原性，当加上多个半胱氨酸残基时也可得到类似的结果，以说明游离巯基半胱氨酸残基的存在可以形成导致更适宜的二级结构的肽二聚体，上述二级结构可在体内导致免疫复合物的形成。根据这一思路，通过在表位肽内突变等引入半胱氨酸从而形成二硫键或是在肽段中引入二硫键是FMD表位疫苗从空间结构上进行构建疫苗的重要方式。CN103193869A将VP1结构蛋白上B细胞表位中的134位氨基酸S换成半胱氨酸C，将156位氨基酸Q也换成半胱氨酸C，并采用固相多肽合成技术将设计好的氨基酸序列用多肽合成仪合成，合成过程中使两个替换的半胱氨酸形成二硫键从而达到环肽的效果。通过氨基酸替换、二硫键形成可以模拟FMDV VP1结构蛋白上的自然构象，达到良好的免疫效果。

3.2 疫苗制备方式

基于前述不同的疫苗构建方式，疫苗的制备方法通常分为生物合成和化学合成。生物合成方式主要涉及原核生物、真核生物、植物表达系统等类型。利用大肠杆菌的原核生物进行融合蛋白或疫苗的表达是疫苗制备领域中常见的蛋白表达的技术手段，CN101376887A、 CN109053898A公开了将涉及FMD表位的融合基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达FMD重组免疫复合肽的基因工程菌。CN102580076A中应用重组DNA技术，合成编码猪O型FMDV表位的DNA序列，构建了pGAPZαA-SP表达载体，并将该重组表达载体转化宿主细胞毕赤酵母。CN1307000A、CN1429906A、CN1429907A、CN1820784A中公开了基于烟草花叶病毒、莴苣叶绿体、油菜叶绿体采用植物表达系统进行的FMD表位疫苗的生产。

在疫苗制备领域中，化学合成方法主要包括固相合成和液相合成两种方方法。结合前述FMD表位疫苗构建方式，向表位疫苗中引入半胱氨酸以形成二硫键的疫苗通常是采用化学方法进行合成。CN102180952A、CN102775478A、CN105418738A中公开了通过固相合成方式合成多肽，并将合成的抗原多肽与佐剂进行混合乳化后得到免疫效果好的疫苗。

4 结语

随着FMD表位疫苗的不断研发，FMD表位疫苗作为新型疫苗因其针对性强、特异性高、广谱性强而脱颖而出。在研制FMD表位的疫苗中主要涉及到两大方面，一是确定FMDV上的表位，二是完善FMD表位疫苗的构建和合成方式。本文以专利数据为基础对FMD表位疫苗的研究进行分析，挖掘 FMDV相关的细胞表位以及表位疫苗的构建与制备方式，为安全可靠的FMD疫苗的研制以及其他疾病的表位疫苗研究提供参考。