苏云金芽胞杆菌生产菌种的筛选

2019-02-16李梅

山东化工 2019年11期

李梅

(浦城县投资开发公司，福建浦城 353400)

苏云金芽胞杆菌简称Bt，它可以用于森林、棉花、玉米、蔬菜、水果以及茶、麻、烟叶等作物害虫，也可用于贮藏害虫和环境害虫的防治，对蔬菜、茶等害虫的防治效果达90%以上，且符合国家食品A级标准，是目前全世界公认明有效、最有前途的生物农药。Bt是目前我国生产和销售量最大的一种生物杀虫剂。

Bt菌种在长期的生产过程中经常会出现退化导致减产，选育高产高效的生产菌种是每一个Bt生产单位菌种科室的首要任务。本文以用凝胶电泳法检测毒素蛋白为初筛条件进行大量初筛，再以小菜蛾生物检测的效价进行复筛。

1 材料和方法

1.1 菌种

WE-2015-1。

1.2 培养基

肉汤培养基：牛肉膏6%、蛋白胨10%、氯化钠0.1%、琼脂2% 1.0 MPa灭菌20 min制成肉汤培养基37℃培养2天后检查无杂菌，接入菌种培养28℃两天制成出发菌种备用。

摇瓶培养基：花生粉1.0%、黄豆饼粉3.6%、淀粉：0.5%、酵母粉0.5%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.1%、氯化锌0.05%、磷酸二氢钾0.1%1.0 MPa灭菌30 min。

1.3 紫外线处理

将培养好的肉汤菌种刮入装有生理盐水的平皿中，用功率15 W、波长256 nm的紫外灯距离30 cm处照射1 min，然后进行稀释10-8稀释自然分离，挑单菌落转入斜面培养。

1.4 菌种初筛

第一步初筛：将经过紫外线处理并经过自然分离的菌株培养于肉汤斜面28℃培养2天，用品红染色液涂片染色镜检伴孢晶体的形态。保留伴孢晶体形态规则、一致、个体较大的或者有特点的菌株进行下一步筛选。

第二步初筛：经过第一步初筛过的选出的菌株，接入摇瓶培养基培养30℃、220 r/min振荡培养40 h后用品红染色液涂片镜检生长较好并且用凝胶电泳法检测毒素蛋白高于出发菌株10%的菌种保留进行下一步的复筛。

1.5 菌种复筛

第一步复筛：将初筛得到的菌株接种到发酵培养基中30℃、220 r/min振荡培养40 h后镜检生长正常，用小菜蛾做生物检测毒力效价高于原出发菌株10%的菌株保留进行下一步的复筛。

第二步的复筛：将第一次复筛得到的菌株接入100 L的中试罐中培养基中30℃、180 r/min通气量1∶1条件下培养40 h镜检生产正常，用小菜蛾做生物检测毒力稳定的菌株作为生产菌种或者作为下一步选育的出发菌株。

2 结果与分析

2.1 筛选结果

经过紫外线诱变处理后，挑单菌菌传斜面培养镜检菌株共2100个，第一步初筛留种率控制在25%左右，第二步初筛留种率控制在30%左右，最后共挑选150个菌落进入复筛。经过两次复筛，选择了WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968用于生产和下一步的选育。

2.2 筛选效果

第一步复筛150个菌株发酵平均效价3860 IU/mL，比对照3199 IU/mL高20.66%。

第一步复筛150个菌株中，有15株发酵效价比对照的低15%，占总数的10%；有30株发酵效价比结照的高20%以上，占总数的20%；有52株的发酵效价比对照的高10%以上，占总数的33.66%。

从上述的结果可以看出，初筛得到的菌株大部分是正突变。经过初筛可以大大减少生物检测量。

2.3 WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968菌株在生产应用

经过多次复筛，得到的菌株WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968 ，在生产中应用WE-2015-1-156共生产120批，平均效价4560 IU/mL，高于去年平均3920 IU/mL，提高了16.07%；WE-2015-1-899生产99批，平均效价4490 IU/mL，比去年提高了14.54%，WE-2015-1-1968生产80批，平均效价4450 IU/mL，比去年提高了13.52%。