调节性B细胞在妊娠过程中的免疫调节研究进展

陈现，何书贵，林蓉，何来宾，曾勇

(深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045)

正常妊娠是一个复杂的生理过程，依赖于母体内由众多免疫细胞及细胞因子参与的精密免疫调控，使得母体对胎儿产生免疫耐受，维持妊娠，一旦这些调控失衡就可能导致不良妊娠[1]。一般认为B细胞可通过产生特异性抗体或多种细胞因子上调免疫反应，也可作为专职抗原呈递细胞参与免疫应答。然而，近年来人们发现了一类具有负向免疫调节功能的B细胞新亚群，即调节性B(Regulatory B，Breg)细胞，可通过分泌抑制性介质如白细胞介素-10(IL-10)，或作用于其它免疫细胞等机制发挥免疫抑制功能，在免疫耐受中起着关键的作用[2]。在自身免疫性疾病、肿瘤、移植耐受及抗感染免疫中，Breg都发挥着重要的免疫调节功能[3]。随着生殖免疫学的发展，免疫因素在成功妊娠过程中的作用受到越来越多的关注。因此本文将简要介绍Breg细胞的表型和功能特征，以及其在妊娠过程中免疫耐受的可能机制，将为进一步探索Breg细胞在妊娠过程中的作用提供新的思路。

一、Breg表型与作用机制

有关Breg分类标准，目前尚不统一，且Breg细胞表面标志物在人类与实验动物中具有不同表达。多数文献根据其分泌的细胞因子以及B细胞的起源和表面标志，将Breg细胞分为3类，即IL-10相关Breg细胞(Br 1)、转化生长因子β(TGF-β)相关Breg(Br 3)以及Foxp3表达相关的Breg细胞[4]。根据Breg细胞分化和激活方式，Breg又可以分为固有型(多克隆刺激诱导IL-10生成)和获得型(抗原特异性IL-10生成)，固有型Breg来源于边缘性B细胞和B-1a细胞，而获得型Breg来源于成熟滤泡性B细胞[5]。此外，学者发现人类周围血CD19+CD24hiCD38hiB细胞具有免疫调节功能[6]。

Breg细胞发挥免疫负调节作用，主要通过以下两条途径实现：(1)Breg细胞可直接通过细胞间相互作用发挥负性调节作用。Rincon-Arevalo等[7]报道，在CD40、MHC-Ⅱ、CD80、CD86和PD-L1信号的参与下，Breg细胞与CD4+T细胞相互作用进而减少增殖和Th1细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)]的产生。Breg还可通过表达糖皮质激素诱导的TNF受体和配体维持调节性T细胞(Treg)数量，从而阻止自身免疫性疾病的发生[8-9]。(2)通过分泌抑制性细胞因子发挥调节作用。Breg细胞还可通过分泌IL-10、IL-35，抑制Th1细胞(Th1和Th17)的增殖和促炎细胞因子(TNF-α、IFN-γ)的分泌；也能够诱导CD4+CD25-T细胞分化成分泌IL-10的Treg细胞，并抑制单核细胞分泌TNF-α。由Breg细胞产生的IgM也能够诱导凋亡体的清除，降调促炎介质的表达[10]。由此可见，Breg细胞主要通过分泌抑炎细胞因子介导各类免疫细胞的增殖和分化，对免疫耐受有着重要的调控作用[11]。

二、妊娠期Breg的变化及其调节

妊娠是一个独特的生理过程，母体通过复杂的免疫调控机制实现了对带有异种抗原的胎儿的接纳。母-胎免疫耐受涉及复杂的母-胎免疫调节过程及机制，以母-胎界面为中心环节，并向母体外周免疫系统扩展，在妊娠相关激素积极参与下，形成复杂的免疫调节环路。雌激素(E2)和孕激素(P4)是妊娠过程中两个重要的调控激素，在妊娠建立和维持中发挥关键作用，对胎盘和胎儿营养所需的血管生成有着重要的调节作用[12]。研究表明，女性性激素可调节蜕膜免疫细胞，如树突状细胞(DC)、子宫自然杀伤性细胞(uNK)，有助于母胎免疫耐受的形成[13]。同样，B细胞也受雌激素的调控，在淋巴细胞增殖过程中，随着雌激素水平的升高，前体B细胞比例降低，而成熟B细胞不断增殖。由此可见，雌激素水平的变化可影响B细胞的成熟，以确保免疫系统能够在必要时保护母体免受病原体的侵袭[14]。研究还发现E2通过PD-1/PD-L1的作用机制，可促进IL-10+Breg细胞比例的增加[15]，从而降调CD11b+CD45hi活化性巨噬细胞、DC和浸滤性CD4+细胞比例[16]。而且，另有学者发现在脑脊髓炎(encephalomyelitis，EAE)动物模型中，P4治疗后可降低EAE的病情，并同时促进IL-10的分泌和CD19+B细胞的数量[17]。这些结果均表明Breg细胞能够通过对雌孕激素反应的响应而调控机体的免疫炎症反应，起着一定的保护作用。

此外，人绒毛膜促性腺激素(HCG)是与妊娠密切相关的糖蛋白激素，由胚胎合体滋养细胞分泌，对E2和P4水平的维持是必不可少的。而且，在HCG等激素的作用下，胚胎及子宫内膜均释放大量细胞因子，构成巨大的信号网络，不断完善自身功能以适应彼此，最终达成母体-胎儿之间的交互对话[18]。HCG对T细胞和uNK细胞有重要的调节作用[19]，近年来人们也逐渐关注HCG对Breg细胞的调控作用。研究发现，95%以上的CD19+CD24hiCD27+Breg细胞表达HCG受体，且体外实验证明向纯化分离得到的CD19+B细胞中加入人重组HCG可诱导Breg细胞的增殖，并分泌大量的IL-10[20]。因此，学者们推测在正常妊娠过程中HCG可促进表达IL-10的Breg细胞的增殖，从而调控不利于成功妊娠的免疫反应。Fettke等[21]报道B细胞和人类绒毛膜癌滋养层细胞(JEG-3)共培养24 h后，结果发现CD19+CD24hiCD27+IL-10+细胞比例显著增加，且IL-10的分泌也显著增加；从分离的CD19+B细胞中，JEG-3细胞悬液能诱导IL-10的分泌。为此，他们使用抗HCG抗体阻断HCG，结果消除了JEG-3诱导 Breg细胞分泌IL-10的作用。因此，滋养层细胞内的HCG能够改变B细胞的表型，并使B细胞具有保护作用。

尽管妊娠期相关激素对Breg细胞数量或功能的调控机制仍有待深入阐明，但我们可以推测妊娠期相关激素如E2、P4和HCG对Breg细胞有着重要的免疫调节作用，有助于妊娠期母胎免疫耐受的形成，以保障正确的母-胎交互作用。

三、Breg与妊娠免疫耐受

正常妊娠类似于成功的同种异体移植，母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥，而且通过精细的母-胎对话，建立独特的母-胎界面免疫耐受微环境，允许胎儿在子宫内生长发育直至分娩。母体来源的细胞、胎儿来源的滋养细胞以及这些细胞产生的各种细胞因子、生长因子、激素等共同构成了母-胎界面特殊的免疫微环境，以维持成功妊娠。Breg细胞在自身免疫性疾病、移植和癌症中的研究均表明：Breg细胞可抑制局部微环境的炎症反应，促进稳定的免疫耐受反应的形成。基于目前国内外文献报道，可推断Breg细胞是妊娠过程中的一个重要调节因子。Breg细胞在自身免疫性疾病中抑制炎症和移植耐受的作用均表明其可能与母体免疫耐受的形成有关，Breg细胞在癌症中促进肿瘤生成的作用也可适应于妊娠的建立，如母体-胎儿同源交互作用可募集Breg细胞，并训导它们发育为Breg细胞，确保胎儿的生长不受干扰[22]。国内外学者对妊娠免疫耐受的机理做了部分深入探索，认为Breg细胞能够调节着床局部免疫功能，通过分泌IL-10和其它的细胞因子诱导免疫耐受的形成，促进胚胎的植入和妊娠的维持。

近年来，对动物实验的研究可直接证明Breg细胞在母胎免疫耐受的调节作用。在自然受孕和自发流产小鼠模型的研究中发现，在自发流产小鼠中B10(Breg)细胞比例显著低于自然受孕小鼠的比例；随后，将B10细胞注射到自发流产的小鼠体内后，结果发现B10细胞可抑制DC的成熟，促进Treg细胞的增殖，从而降调母体对胎儿的免疫排斥反应，可有效降低自发流产的风险[23]。而且，被认为与成功妊娠密切相关的另一种Breg细胞，即边缘区(MZ)B细胞，在正常妊娠小鼠的脾脏中可被观察到，而妊娠并发症的小鼠中则观察不到。另外，成功妊娠与MZ B细胞表达免疫球蛋白(IgM和IgA)的能力有关，可促进Th1型免疫反应向Th2型免疫反应的转换[24]。尽管IL-10也具有同样的作用，但目前尚无证据表明MZ B细胞表达的细胞因子在成功妊娠中的调节作用。

对人类的研究发现，在妊娠早期正常妊娠女性周围血中CD19+CD24hiCD27+Breg细胞的比例显著高于自发流产女性的细胞比例[20]。体外研究显示，从妊娠早期孕妇周围血中分离得到的Breg细胞可抑制活化的效应T细胞分泌TNF-α[24]。有趣的是，Lima等[25]对35名非妊娠妇女和43名妊娠妇女的研究发现，在脂多糖刺激下，与非妊娠组相比，妊娠组CD24hiCD27+Breg细胞和CD24hiCD38hiBreg细胞绝对值在妊娠晚期和分娩日显著降低，作者认为这可能与能够影响B细胞活化有关的性激素水平下降有关。此外，还有研究发现Breg细胞产生的TGF-β能够抑制CD8+毒性T细胞的增殖和分化，降低母体对胎儿的排斥反应[26]。以上的研究均表明，Breg细胞在妊娠不同阶段对母体免疫耐受的建立和维持具有重要的调节作用。尽管目前对Breg细胞功能在人类妊娠过程的作用研究较少，但是Breg细胞介导的免疫抑制作用与在自身免疫性疾病、宿主移植耐受和癌症中的功能比较相似。基于此，Breg细胞可通过促进Treg细胞的增殖，调控Th细胞反应，抑制效应细胞如细胞毒性T细胞、NK细胞和DC的免疫反应，从而促进免疫抑制性微环境的形成。

虽然妊娠过程中Breg细胞的功能似乎与Treg和DC相互联系，但明确其作用机制是必要的。Treg细胞和DC对妊娠结局的影响至关重要。在正常妊娠过程中，大部分蜕膜DC细胞处于未成熟状态以维持局部耐受性微环境的形成。这些未成熟的DC被认为是耐受性的DC[27]。Treg细胞在建立和维持母-胎免疫耐受中同样有着重要的贡献。在小鼠发情期可观察到Treg细胞的增殖，促进同种异体胚胎的植入[28]。在胚胎植入早期，Treg细胞在动脉旁淋巴结中募集，随后转移到子宫中[29]。Treg细胞的增殖与成功妊娠率密切相关，在妊娠不同时期中子宫Treg细胞数量不足均可导致流产的发生[30]。因此，在妊娠过程中，耐受性DC和Treg细胞通过分泌抑炎细胞因子IL-10和TGF-β而调节胎儿耐受环境的形成[31]。若抑炎信号IL-10和TGF-β缺失，则耐受性的DC仍可抑制T细胞的活化，从而保护同种异体胎儿免受母体免疫系统的排斥[32]。因此，DC保持其未成熟状态可有助于耐受性表型的形成。由此得知，IL-10和/或TGF-β必须在妊娠起始时就存在，以备于诱导耐受性DC形成后进而促进Treg细胞的增殖分化，或者直接诱导Treg细胞的增殖分化。然而，基于Breg细胞以下几点：(1)是分泌IL-10和TGF-β的主要细胞；(2)在正常妊娠过程中Breg细胞数量显著增加；(3)能响应内分泌调节系统的变化，我们可以推测Breg细胞在妊娠过程中同样有着重要的作用，尤其是在母体免疫耐受形成的最初阶段必不可少。Jensen等[23]研究结果支持这一观点，即在妊娠小鼠中B10细胞分泌的IL-10通过与富集DC上IL-10受体相互作用后，抑制DC的成熟，进而促进Treg细胞的增殖发育。因此，根据目前文献所报道的这三种免疫细胞相似的免疫抑制作用及相互调节作用，学者提出Breg细胞在妊娠耐受的建立过程中：通过CD80/CD86共刺激信号或IL-10和TGF-β的表达而直接诱导Treg细胞增殖；或者通过IL-10抑制DC的成熟诱导耐受性DC的形成，进而诱导Treg细胞的增殖；而Treg细胞和耐受性DC也能分泌IL-10，能够维持妊娠期负性调节的反馈作用[22]。然而，Breg细胞在妊娠期招募Treg和DC的具体作用机制处于未解之谜。

四、展望

Breg细胞在妊娠过程中扮演着重要的作用，主要通过分泌IL-10或TGF-β，抑制母体T细胞产生的不良免疫反应，因此对耐受性的识别非常重要[20]。众多文献已证实，Breg细胞免疫抑制作用在妊娠发展过程中起到重要的负性调节作用，Breg细胞的发现和研究为临床治疗不良妊娠结局提供了理论基础。然而目前关于Breg细胞在妊娠过程中的研究主要关注于周围血中的作用，对母胎界面局部Breg细胞数量和功能的研究较少，而母胎界面的免疫状态对胚胎的粘附、生长、发育提供了重要的物质基础，这一免疫耐受的调节与Breg等其他免疫细胞发挥正常的功能是不可或缺的。同时，Breg细胞表型和在妊娠不同阶段细胞数量的变化和具体作用机制，以及与其它免疫细胞的相互作用等尚未阐明，这些问题有待于我们进一步深入思考和探究，期待将来更多Breg的临床研究能为不良妊娠结局患者带来治疗希望。