兔VX2 肿瘤模型的研究进展

米金霞， 方肇勤

(上海中医药大学1. 基础医学院， 2. 科技实验中心， 上海 201203)

我国最新癌症统计数据显示，2015 年全国癌症新发病例为429.2 万，其中死亡人数达281.4 万，死亡率最高的肿瘤分别为肺癌、胃癌、食管癌和肝癌，癌症因其高发病率和死亡率，已经成为中国人口死亡的主要原因和公共健康问题[1]。中国的抗癌形势非常严峻，国家每年投入大量的人力财力进行肿瘤基础研究及药物的研发。目前在肿瘤研究中，比较常用的是裸鼠人癌移植瘤模型，但该类模型大多用于肿瘤药物的开发，因体型小并不适合作为手术、介入等研究的模型。VX2 是一种常用的可在兔身上建立的模型，易于复制，在外科可操作性和影像学方面有较大优势，容易实施血管介入、射频消融等操作，应用广泛[2]。本文通过文献检索和整理，概括了以下几个方面的内容。

1 VX2 细胞的来源及生物学特性

VX2细胞是由Shope病毒感染形成的兔乳头状瘤，经过72 次移植传代，建立的稳定的肿瘤细胞系，最初由Rous 等[3，4]报道。该细胞是上皮细胞恶性肿瘤，属于鳞状细胞癌，可接种于多个部位建立原位肿瘤动物模型。利用VX2 细胞建立的肿瘤模型具有生长迅速、血供丰富、容易侵袭周边组织和转移的特点。

2 VX2 细胞的形态和传代

2.1 VX2 细胞的形态

VX2 细胞系不同于一般的小鼠或人癌细胞系，在体外培养的报道较少。将荷瘤兔的肿瘤组织在体外培养后， 可观察到VX2 细胞的形态及其生物学特性。刘险峰等[5]观察到VX2肿瘤细胞的形态为多角形、短梭形， 贴壁生长， 体外培养倍增时间为34.5 h，细胞周期测定G1 期为69.3%、G2 期为5.6%、S期为25.1%。苏畅等[6]采用类似的方法观察到VX2细胞多呈圆形、多角形的上皮细胞，核大、核质比异常、异形性明显，细胞倍增时间为26.4 h，细胞周期测定G1 期为74.61%、G2 期为7.78%、S 期为17.6%。

2.2 VX2 细胞的传代

VX2 细胞因在体外培养不易成功，大多采用体内传代的方式。这可能与体外纯化的细胞经过多次传代后容易出现成瘤力下降及自发性消退现象有关。目前，VX2 细胞传代一般以液氮冷冻组织块和动物活体传代两种方法结合的形式保存。

液氮冷冻的方法是将荷瘤兔的新鲜鱼肉样肿瘤组织洗净，剪碎成体积较小的肿瘤块，以细胞冻存的方式保存在液氮中，需要时常规复苏即可。

活体传代大多采用兔后肢肌肉接种，将肿瘤生长至2～3 周的荷瘤兔麻醉后，选取肿瘤生长旺盛的鱼肉样组织，剪碎至1～2 mm3大小的瘤块，用眼科摄或注射器等接种至兔后腿肌肉内以保种传代。皮下方式一般不推荐，因VX2 肿瘤生长迅速，极易发生表皮溃烂。

液氮冷冻保存占用空间少，灵活方便，节省了使用实验动物的各种费用，但因肿瘤活性降低而影响到模型动物的成瘤率； 活体传代成瘤率高，但需要长期饲养兔，增加了实验成本。因此在研究过程中可以采取两种方法结合的形式，在模型建立之前先将冻存的肿瘤接种至兔后肢肌肉，经体内生长适应后，再行大规模肿瘤模型的建立。

3 兔VX2 肿瘤模型的建立

3.1 建立方法

目前建立兔VX2肿瘤模型常用的方法包括细胞悬液法和瘤块接种法。

3.1.1 细胞悬液法 将一定数量的VX2细胞注射至建模部位形成相应的肿瘤模型，采用的细胞悬液根据其来源可分为两种情况。一种是体外培养的肿瘤细胞，如赵中辛等[7]用法国Pasteur 研究所提供的VX2细胞悬液建立肝肿瘤模型； 王光大等[8]采用同行惠赠的VX2细胞接种于脾脏建立肝转移瘤模型。但VX2细胞在体外培养时随着传代次数的增多，使用的酶消化法破坏了肿瘤细胞与亲本细胞间的关系，使细胞的侵袭性降低， 模型的成功率也受到了影响。因此有学者尝试另一种细胞悬液的制备： 将VX2荷瘤兔身上的新鲜肿瘤组织进行匀浆或研磨、过滤形成肿瘤组织细胞悬液，这种方法制备的细胞悬液适应性强， 能够抵抗机体的免疫力， 成瘤率比采用体外培养的肿瘤细胞悬液更高。Li等[9]将VX2肿瘤组织制备的细胞悬液接种至肝脏， 3～4周就可以在B超下观察到肿瘤的位置和大小。Ahn 等[10]将VX2 肿瘤细胞悬液接种于肾脏水平位置双侧脊椎旁的肌肉， 接种10～12 d 后肿瘤体积为(6.0±2.9) cm3， 17～19 d肿瘤体积为(13.5 ± 5.3) cm3。丁玖乐等[11]在研究中并未指明采用的细胞悬液属于哪一种。因此研究人员在参考时一定要仔细判断，尽可能提高肿瘤模型的成功率，减少验证的时间。

3.1.2 瘤块接种法 将生长了2～3周的荷瘤兔麻醉后，选取边缘生长旺盛的鱼肉样瘤组织，经磷酸缓冲液(PBS)或生理盐水清洗后，去除坏死组织和结缔组织，用手术剪刀剪成0.5～2 mm3大小的肿瘤块，用穿刺针或注射器将瘤块接种至建模部位，借助明胶海绵或医用吻合胶可以起到封堵、提高成瘤率的作用。余梁等[12]用肿瘤块接种、明胶海绵封堵的方式建立兔VX2 肝癌模型，大大提高了成模率，且降低了肿瘤块从穿刺道掉落形成异位肿瘤的风险。于涛等[13]将肿瘤组织块接种至胫骨骨髓腔内，再用骨蜡封口，建立兔VX 2 骨转移瘤模型。Tong 等[14]预先将肿瘤块嵌入明胶海绵植入肝左叶，再用明胶海绵封堵建立VX2 肝癌模型， 不仅节约了手术时间， 而且减少了肿瘤渗漏和异位播撒的发生。

肿瘤的大小和生长速度与接种瘤块的数目和大小有关，并且随着肿瘤的逐渐增大，兔也会出现相应的症状。张贵祥等[15]在研究中观察到兔VX2肿瘤在2 周时直径可达1～2 cm，兔活动减少，食欲下降； 3 周时肿瘤可达3～4 cm； 4 周达5～7 cm，出现后肢瘫痪、乳白色尿等症状； 5 周后肿瘤直径可超过10 cm。一般肿瘤在2 周后包膜形成，肿瘤内坏死液化。

3.2 模型类型

根据移植部位的不同可以建立多种类型的兔VX2 肿瘤模型， 如乳腺癌、肝癌、直肠癌、骨癌、肾癌等。Pascale 等[16]将肿瘤组织小心挤压通过200 μm 尼龙筛， 离心混悬， 取0.2 mL 含有5×106个细胞注射至胸部乳腺的脂肪垫下建立兔VX2乳腺癌模型。Zhang 等[17]将组织块接种在肝左叶建立兔VX2 肝癌模型，观察经肝动脉栓塞(TAE)和缺氧复制型溶瘤腺病毒的联合抗肿瘤效果。孙轶群等[18]将瘤块接种至直肠壁内，并用生物OB 胶封闭进针口，建立直肠癌淋巴结转移模型。许建东等[19]接种瘤块至后腿肌肉建立兔VX2骨骼肌肿瘤模型，并观察了蜂胶在免疫方面的抑瘤效果。马雅昌等[20]建立兔VX2 骨癌模型，利用自制的高分子封堵栓封堵穿刺孔有效降低了骨肿瘤穿刺后瘤细胞早期扩散的发生。

随着各类影像设备的应用，研究人员亦可以借助先进仪器，快速、高效地在各个脏器建立VX2原位移植瘤模型。原位移植瘤模型可以采用开腹直视或经皮穿刺的方法。含笑等[21]用开腹直视的方法， 以腹正中偏左切口进入， 先用4F 扩张鞘管斜刺肝左叶，再用鞘管内芯推送肿瘤块，并用明胶海绵条封堵穿刺通道，建立兔VX2 肝癌模型， 大大降低了肿瘤在网膜及腹壁种植的机率。金光鑫等[22]比较了核磁共振(MR)导引穿刺法和传统开腹法建立兔VX2肝癌模型的研究， 成瘤率前者为93.7%， 后者为87.5%，且MR 经皮穿刺法具有创伤小，感染率低的特点。张强等[23]采用计算机X射线断层扫描(CT)导引经皮穿刺的方法，将肿瘤块及明胶海绵预装在穿刺针内，建立兔VX2 肝癌模型和肾癌模型，成瘤率为100%和90%，手术方法简便省时，肿瘤有孤立单发的优势。

4 兔VX2 肿瘤模型的研究应用

兔V X 2 肿瘤模型主要应用在磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、射频消融(radiofrequency ablation， RFA)、和TAE 等方面的实验研究中， 是目前用于影像研究最为理想的实验模型。

4.1 在MRI 的应用

MRI避免了使用对人体有害的X射线和易引起过敏反应的造影剂， 且分辨力高， 对全身各系统疾病，尤其是肿瘤的诊断有着重要的作用。Li等[24]借助动态增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging， DCE-MRI)和微血管密度(microvessel density，MVD)评价兔VX2 后肢肌肉肿瘤生长过程中血管生成情况，发现肿瘤新生血管是一个动态的过程， 在接种后2 周达到峰值， 之后逐渐下降，对肿瘤抗血管生成药物的使用具有指导意义。潘江洋等[25]利用DCE-MRI 定量评估兔VX2 肝癌模型经索拉非尼靶向治疗前后的血管生成变化， 发现Ktrans、Kep 值的下降具有统计学意义， 且与MVD、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)之间有线性关系，DCE-MRI 可以用于抗肿瘤血管生成的疗效评估。王攀鸽等[26]用MR 淋巴造影(MR-LG)显像兔VX2 乳腺癌模型，发现MR-LG 可以很好地区分内乳前哨淋巴结(SLN)及淋巴管。

4.2 在RFA 的应用

局部消融治疗具有创伤小、疗效确切的特点，使一些不耐受手术切除的肝癌病人获得治疗的机会。但RFA 因治疗不足、残留肿瘤的存在以及治疗后局部肿瘤的复发和转移， 影响了治疗效果[27]。刘亚等[28]观察RFA 治疗兔VX2 肝癌后针道区、热凝固区和消融交界区病理改变、VEGF 表达及凋亡情况， 结果显示针道区肿瘤细胞大量坏死， 核碎裂、固缩， 一周后出现溶解液化及血栓， 并随着时间的延长逐渐加重，热凝固区肿瘤坏死细胞和大量巨嗜细胞、中性粒细胞共存，消融边界区以炎性细胞为主； 从手术操作区往外VEGF 依次降低、细胞凋亡依次增加。邹孟达等[29]观察环五肽RGD(TyrRGD)靶向的纳米金颗粒(GNPs)耦联 VEGF 小干扰 RNA(TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA)复合物与RFA的协同效应，结果证实该复合物不仅可促进肿瘤细胞的凋亡，还能延长兔VX2 肝癌模型的生存时间， 最长生存时间达90 d。赵艳萍等[30]在CT 导引下经皮穿刺单次RFA， 观察兔VX2肝癌在RFA后局部肿瘤进展(local tumor progress， LTP)的发生， 发现其主要与射频范围不足有关， 射频针周围更容易产生LTP。明韦迪等[31]利用兔VX2小腿肿瘤模型， 射频干预5 min，ELISA法检测干预前后不同时间耳缘静脉血中热休克蛋白(HSP)70、白细胞介素(IL)-6 和IL-8 的表达，结果显示HSP70 及IL-6 表达量升高，IL-8 的表达量降低，表明射频干预可以促进机体的抗肿瘤免疫反应。为了提高RFA 的治疗效果，研究人员尝试RFA联合其他药物或局部操作的相关研究[32]，比如Jiang 等[33]联合抗免疫疗法抑制肿瘤的增殖及转移，李浩等[34]联合TACE 减少肿瘤周围血液的灌注。

4.3 在TAE 的应用

Tomozawa等[35]通过兔VX2肝癌模型实验研究表明索拉菲尼与TAE 联合应用时，索拉菲尼应在TAE 操作之前或同时给药，能够更有效抑制肿瘤。Zhang等[36]通过研究表明， 姜黄素脂质体可以抑制兔VX2肝癌模型经TAE引起的HIF-1α和survivin表达水平的增高以及血管的生成，能够通过调节细胞增殖和凋亡相关分子起到抗肿瘤的作用。黄巧胜等[37]研究显示，兔VX2 肝癌模型在实施经肝动脉灌注雷替曲塞后，血浆中血药浓度降低，药物大多沉积在肿瘤区，对肿瘤发挥最大治疗效果的同时，降低了全身的不良反应。

4.4 在抗肿瘤药物研发中的应用

刘宇等[38]用兔VX2 肺癌模型观察多西他赛脂质体的疗效和安全性。董胜利等[39]建立兔VX2 肝转移瘤模型，开发肿瘤耐药的相关药物，发现以Pll-nHAP 为载体的P53 基因协同Rb 基因的纳米靶向治疗，可通过调节肿瘤细胞多重耐药机制中的重要基因PGP、BCRP 的表达，增强其对化疗药的敏感性，P53 基因联合Rb 基因的纳米基因靶向治疗有可能成为针对肝转移灶多药耐药的有效治疗方法。梁琪等[40]利用兔VX2 肝癌模型评价超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)纳米药物载体在TACE 治疗中的效果，证实SPIO 纳米药物载体联合LIP 具有良好的MRI 和CT 可视性，可提高兔VX2 肝癌的化学药物栓塞治疗的效果。传统药物在TACE 后容易进入体循环，使肿瘤化疗不彻底，全身副作用大，戴海涛等[41]成功制备阿霉素负载的叶酸靶向的磷酰胆碱修饰氧化石墨烯，表明在治疗后药物主要沉积在肿瘤区域内，提高了化疗效果，降低了副作用。

4.5 其他应用

兔VX2肿瘤模型在新兴治疗方法和仪器的开发中也广泛应用。高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)除了被用于疾病的常规诊断，也是一种新兴的肿瘤治疗手段，它通过将超声波聚集于人体靶组织，使得靶区局部温度迅速升高，继而导致靶区内细胞产生坏死、凋亡或其他热效应、空化效应，从而达到治疗目的。Sun等[42]在研究中采用兔VX2 肌肉肿瘤模型，在MRI导引下利用HIFU 明显增加了肿瘤组织的渗透性，使24 h 药物吸收率增加34.5%，为肿瘤药物的使用提供了新的思路。陈云卫等[43]观察射频凝血器在兔VX2 肝癌切除术中的作用，发现其可以减少出血量、降低并发症。宋春慧等[44]利用兔VX2 肝癌模型，研究经氩氦刀冷冻治疗后，增强CT、增强MRI 和超声造影等影像设备对疗效的评价。

5 总结

兔VX2肿瘤模型作为在较大动物身上复制的模型已经在影像、介入、外科操作等研究领域广泛应用。该模型因有较高的肺转移发生率[45]，有望成为抗肿瘤转移机制研究及药物开发的理想动物模型。此外，中医中药作为全身治疗的方法之一，能够改善症状，提高机体的抵抗力，减轻放疗化疗不良反应，提高生活质量，在肿瘤的综合治疗中发挥着重要的作用[46]。尤其是中药有很多免疫调节的有效成分，如姜黄素、多糖等联合RFA 可以明显提高抗肿瘤作用[47，48]。本课题组正在开展兔VX2肿瘤模型辨证论治及实体瘤中心变性粉碎引流术综合治疗方案的相关研究[49]，发现该模型有一定的局限性，比如缺乏可用的抗体，无法通过FLISA或免疫组织化学染色法测定特异性的生长因子和细胞因子， 限制了进一步的机制研究[50]。因此，研究人员在实验过程中需要结合研究目的，选用合适可行的评价方法，如影像学指标、病理学指标等，而且要不断优化建模方法，尽可能建立大小一致、位置统一的标准化肿瘤模型。