中毒剂量下维生素D3 对大鼠肾脏的影响

史向华， 杨文彬， 薛润苗， 赵静宇， 续 艳， 张彩峰， 柴秋彦

(山西省医药与生命科学研究院药理研究室， 太原 030006)

维生素D3(VitD3)属脂溶性维生素，是维持生命所必须的营养素之一， 它有两种形式， 即胆钙化醇(VitD3)和角骨化醇(VitD2)[1]。VitD3对人体的骨骼发育极为重要，其主要功能是促进钙、磷在肠道的吸收， 维持血清钙和磷的浓度在正常范围内，并促进钙在骨组织中的沉积，维持人体骨骼的健全以及神经肌肉功能的正常。此外，VitD3还具有免疫调节功能，参与人体对感染的反应。当VitD3不足时，在小儿可引起佝偻病(俗称缺钙)， 在成人则可引起骨软化症(特别是妊娠和哺乳期的妇女)，与老年人的骨质疏松症也有密切关系。目前，维生素VitD3在临床得到了广泛的使用，作为动物生长和维持生命所必须的营养素之一，在动物饲料配制中，也进行了大量的添加使用。VitD3虽是发育不可缺少的营养成分，但并不是摄入越多越好，过量服用会引起中毒[2]。VitD3中毒常是因为使用不当，或是在治疗佝偻病的过程中反复大量使用VitD3所致[3]。VitD3产生的中毒症状是通过增加肠钙的吸收而造成血液中钙水平升高所引起的。当血清钙浓度超过110～130 mg/L 时，出现全身症状，如乏力、口渴、食欲不振、意识障碍等。急剧发生重症高钙血症会引发高钙血症性肾危象，表现为以急性肾小管坏死为特征的急性肾功衰竭[4]。在某些情况下，肾损害可能是不可逆转的。本实验拟通过给大鼠摄入大剂量的VitD3，探讨中毒剂量VitD3对肾功能的生化指标、肾组织自由基及钙离子沉积的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级5 周龄SD 大鼠，40 只，雄雌各半，体质量150～170 g，购自河北医科大学实验动物中心[SCXK(冀)2008-1003]，饲养于山西省医药与生命科学研究院药理研究室SPF屏障级动物房[SYXK(晋)2017-0001]。

1.2 主要试剂

VitD3注射液(7.5 mg/mL)， 购自上海通用药业股份有限公司生产(批号： 20100106)； 超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号： 20130408)， 丙二醛(MDA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)和尿酸(UA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号： 20130416)，血液钙(Ca2+)定量检测试剂盒，购自中生北控物科技股份有限公司(批号： 2010416)。

1.3 主要仪器

电子天平(型号BT2202S)购自北京赛多利斯仪器系统有限公司， 全自动生化分析仪(型号ChemWell 2910)购自金西盟(北京)仪器有限公司， 半自动酶标仪(型号R960型)购自长春赛诺迈德医学技术有限公司， 光学显微镜(型号BH-2 型)购自日本Olympus 公司， 全自动五分类动物专用血液分析仪( 型号HEMAVET950型)购自北京卓越励新有限责任公司，原子吸收光谱仪(型号DUOAA)购自安捷伦科技(中国)有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将40 只SD 大鼠随机分为正常对照组、VitD3低剂量组(1 875 IU/kg 组，VitD3Ⅰ)、VitD3中剂量组(3 750 IU/kg 组，VitD3Ⅱ)、VitD3高剂量组(7 500 IU/kg 组，VitD3Ⅲ)和VitD3超高剂量组(15 000 IU/kg 组，VitD3Ⅳ)5 组，每组8 只，雌雄各半； 动物在实验前不禁食，不禁水。

1.4.2 给药途径、剂量和时间 VitD3注射液，以玉米油进行等量递增稀释，分别配成所需浓度，每日临用时现配。每日灌胃给药1 次，给药体积为 0.5 mL/100 g，连续3 周； 对照组大鼠灌胃等量生理盐水。

1.4.3 样本采集 血清样本采集，禁食过夜后称量体质量，用乙醚麻醉大鼠，采用腹主动脉采血，血样自然凝固后离心(4 ℃，3 000 r/min) 10 min，取上清液贮存于-4 ℃待测。

肾组织Ca2+含量测定样品制备，精确称取干燥后样本约0.5 g 于250 mL 高型烧杯，加混合酸消化液20～30 mL，上盖表面皿。置于电热板或沙浴上加热消化。如未消化好而酸液过少时，补加消化液， 继续消化， 直至无色透明。加5 mL 水， 加热以除去多余的硝酸。待烧杯中液体量约2～3 mL时，取下冷却。用20 g/L 氧化镧溶液洗并转移于10 mL 刻度试管中，定容待测。

1.4.4 样本测定 体质量增长测定， 分别在实验1 d、9 d、18 d、21 d 用电子天平称量并记录体质量。

血清生化指标测定，利用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)； 按试剂盒说明书分别测定MDA、SOD。

肾组织Ca2+含量测定， 取肾组织精密称量， 按1∶9 加入冷藏的生理盐水， 剪碎， 匀浆， 3 000 r/min离心10 min，取上清液，以原子吸收光谱仪测定；取与消化试样相同量的混合酸消化液，按上述操作试剂空白测定。

1.5 数据统计分析

SPSS l9.0统计软件进行分析， 实验数据以x- ± s表示，组间比较采用LSD-t 法进行分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

对照组大鼠精神状态良好，被毛光亮，活动如常，能自由进食饮水。Vit D3用药各组大鼠，在1 周时，外观被毛、活动、饮食、排便及体质量增长等一般状况，与对照组无明显差别； 2 周时，VitD3Ⅲ和VitD3Ⅳ组大鼠的一般状况欠佳； 3 周时，VitD3Ⅲ和VitD3Ⅳ组大鼠活动及饮食明显减少，被毛无色泽。

2.2 大鼠体质量

3 周后，VitD3 Ⅲ和Ⅳ组雄性大鼠的体质量增长明显降低(P＜0.05)； 雌性大鼠体质量增长略有减缓(P＞0.05)。与低剂量组比较，VitD3Ⅲ和Ⅳ在连续给药21 d，雄性大鼠体质量随着剂量的增加，体质量增长明显减缓(P＜0.05)， 给药期间，雌性大鼠体质量无明显变化，详见表1。

2.3 大鼠血清BUN 和Cre 浓度

连续3 周后，与对照组比较， VitD3Ⅲ和Ⅳ组大鼠BUN 含量明显下降(P＜0.05，P＜0.01)； 各剂量组大鼠Cre 含量随着剂量增加明显下降(P＜0.05，P＜0.01)，详见表2。

2.4 大鼠血清和肾组织 Ca2+、SOD 和MDA 含量

给药3周后，VitD3中剂量起各组大鼠血清Ca2+含量明显上升(P＜0.05， P＜0.01)(表3)； 肾组织Ca2+含量随着剂量的增加逐渐升高(P＜0.05， P＜0.01)(表3)。

用药3 周后，与对照组比较， VitD3Ⅲ和Ⅳ组大鼠血清SOD含量随着剂量的增加逐渐降低(P＜0.05，P＜0.01)； VitD3Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组大鼠血清MDA含量随着剂量增加逐渐升高(P＜0.05， P＜0.01)(表3)。用药3 周后，与对照组比较，VitD3Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ剂量组大鼠肾组织匀浆MDA含量未见明显的变化， VitD3Ⅳ组MDA 含量均明显降低(P＜0.01)(表3)。

表1 VitD3 对大鼠体质量的影响 g

表2 VitD3 对各组大鼠BUN 和Cre 的影响

3 讨论

体质量增长是反映实验动物一般生理状况的重要指标，特别是在药物的毒性实验评价中，是必须考察的项目。本实验结果显示， Vit D3用药组大鼠在连续3周用药后， 体质量增长均有减缓， 与对照组相比， 雌性大鼠差异无统计学意义， 但雄性大鼠体质量增长则明显降低， Vit D3在7 500 IU、15 000 IU剂量时， 增长停滞， 体质量下降， 说明在此剂量时， 对大鼠的正常生理代谢功能造成了严重干扰， 出现了明显的毒性。并说明雄性大鼠比雌性大鼠更为敏感。

表3 VitD3 对各组大鼠血清和肾组织 Ca2+、SOD 和MDA 含量

血清BUN、Cre含量是临床上反映机体肾脏功能的常用指标， 其含量的高低， 可以敏感反映肾小球的滤过功能和损害程度[5]。在有关实验性肾功能损伤的研究中，都把血清BUN、Cre 含量作为衡量肾功能的主要指标之一，但尚未见大剂量Vit D3使用于大鼠造成中毒而引起血清BUN、Cre含量升高的报道。本实验结果显示，在中毒剂量范围内的大鼠血清BUN、Cre含量随着剂量的增加而相应的下降， 同对照组比较， 差异具有统计学意义(P＜0.01)，可能在此中毒剂量时， 严重干扰了大鼠体内蛋白质和肌肉的合成和代谢， 使相应的代谢产物减少所致。

近年来的研究[6]表明，氧化应激损伤是肾损伤发病的重要机制之一。有文献[7]通过实验证实VitD3能促进氧化作用产生过氧化物即VitD3自由基，后者造成细胞膜的脂质过氧化，引起组织损伤。细胞膜受损后，即使血钙不升高，也可发生营养不良性钙化。本实验所用剂量下，大鼠血液过氧化物歧化酶SOD 含量明显降低，MDA 含量明显上升，说明实验大鼠使用VitD3可以使血清中SOD浓度下降，MDA 活性增高，造成肾脏组织的自由基损伤，同文献报道的研究结果相似。同时也提示大剂量使用VitD3后造成机体自由基增加造成的氧化应激性损伤，可能是大剂量使用VitD3后产生肾脏毒性作用的机制之一。

实验结果表明，1 875～7 500 IU/kg 剂量下，大鼠肾组织匀浆SOD、MDA 含量没有明显变化，但在15 000/kg 剂量时明显降低， 与大鼠血清SOD、MDA 含量测定结果相反，排除实验结果误差外，尚无法作出合理的解释，有待进一步研究探讨。VitD3用药组肾组织Ca2+含量随着剂量的增加逐渐升高，与对照组比较，差异有显著或十分显著的统计学意义，说明大剂量使用VitD3时可造成大量Ca2+在肾组织中沉积，是造成肾脏毒性的主要原因。结果同以往文献[8，9]报道结果一致。

本实验结果表明， VitD3在7500～15 000 IU/kg 剂量，已经达到引起大鼠肾脏毒性的剂量。