基于动物福利的雌性生殖发育毒性体外培养技术研究进展

陆 琴， 周跃华， 唐海飞， 王智文， 张 婷

(1. 上海交通大学医学院附属同仁医院， 上海 200336；2. 上海市计划生育科学研究所， 国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室， 上海生殖健康药具工程技术研究中心， 上海 200032；3. 上海应用技术大学生物工程系，上海 201418）

生殖发育毒性是指外源物质在动物繁殖周期的任何一个阶段中所产生的毒副作用，既包括外源物质对亲代生殖功能的影响，也包括对子代发育过程的有害影响。我国列入各类商品(药品、食品、化学品和化妆品)毒性检测指南的标准方法均来源于国际经济合作与发展组织(The Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)或者人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use， ICH)[1-2]。传统的生殖发育毒性检测以动物试验为主， 包括分娩前发育毒性研究(OECD TG 414)、一代动物毒性研究(OECD TG 415)、二代动物毒性研究(OECD TG 416)、生殖毒性/发育毒性筛选检测(OECD TG 421)、重复剂量毒性研究结合生殖毒性/发育毒性筛选检测(OECD TG 422)， 以及2009 年发布的Hershberger 实验(TG 411)和讨论中的发育神经毒性试验(TG 426)[3-5]。完整的生殖发育毒性研究包括成年动物从受孕到子代性成熟的各个发育阶段接触受试物的反应。化学物的生殖发育毒性有2个显著的特点： ①生殖系统较机体的其他系统对化学物的毒性作用更为敏感； ②损害作用不仅影响接触化学物质的母体本身，还可影响其后代。鉴于哺乳类动物繁殖过程的复杂性，因此需要对繁殖过程的各个方面进行毒理学分析，包括致畸性、内分泌干扰、母细胞突变、生育受损等[6]。2011 年7 月28 日OECD 提出了一项试验指南， 称为延长一代生殖发育毒性研究(OE CD TG443)， 用于替代一代和二代动物毒性研究(OECD TG 415 和416)[7]，这项指南将动物福利等因素考虑进去，最大程度减少了实验动物的使用[8]。

目前全世界每年用于实验的动物数以千万计，实验啮齿类、实验兔、犬、猪、牛、羊及非人灵长类动物等被广泛用于科学实验，引发动物保护组织的持续关注。促进3R，即减少(Reduction)、替代(Replacement)、优化(Refinement)理论发展，是实验动物使用者的责任[9]。毒理学替代方法指能替代动物实验、减少所需动物数量或使动物实验程序得以优化而减少动物痛苦的任何方法或程序。其范围主要包括用组织学、胚胎学、细胞学或计算机等方法取代整体动物实验，或以低等动物取代高等级动物等。生殖和发育毒性检测中使用的动物数量较多， 但因哺乳动物生殖周期的复杂性， 生殖发育毒性替代方法的研究一直在进行中[10]。已有3 种体外模型，全胚胎培养试验(whole embryo culture test，WEC)、微团检测法(micromass test，MM)[11]和胚胎干细胞试验(embryonic stem cell test，EST)[12]于2003 年正式通过欧洲替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods， ECVAM)验证， 并作为胚胎发育毒性的筛选方法[13]。生殖发育毒性体外替代优化方法的研究思路是将整个繁殖过程分成数个连续的生物学部分，分别对其进行单独或联合研究，最大程度地鉴定出外源毒性物质的靶器官或组织。目前，已经探索出一些很有前景的体外模型和方法，本文重点介绍雌性生殖发育毒性研究中体外培养技术研究进展。

1 雌性生殖系统组织和细胞培养

1.1 卵巢颗粒细胞培养

1.1.1 原代卵巢颗粒细胞培养 采用成年雌性大、小鼠动情周期的窦状卵泡或21～30日龄幼年大鼠经注射孕马血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)或埋置已烯雌酚作72～96 h 预处理后的卵巢，体外分离和加入刺激因子培养颗粒细胞。加入外源物质和细胞相互作用，随后检测细胞存活率和测定细胞分泌产物(雌二醇和孕酮)含量以评价颗粒细胞的功能状态。该体外模型可以用来初步筛选影响颗粒细胞生长和发育的外源物质，缺陷是只能研究颗粒细胞的单一功能，不能研究对卵母细胞及其与卵泡膜细胞之间的相互作用，不能动态观察卵泡形成过程和配子发生[14，15]。

1.1.2 永生化的颗粒细胞甾体生成试验 在化妆品生殖和发育毒性检测方法中选用永生化的小鼠颗粒细胞系NT-1和变异株NT-1-hAROM(表达人芳香化酶基因)，研究外源物质对颗粒细胞甾体生成水平的影响。如检测对孕酮生成的影响，可将NT-1 细胞与不同浓度受试物孵育，免疫法测定上清液中孕酮含量，贴壁细胞采用MTT 法或者CCK-8 法进行细胞活性测试。如检测对雌二醇生成的影响，可将NT-1-hAROM细胞与芳香化酶的底物雄烯二酮共孵育，酶联免疫法测定培养液中的雌二醇的产量，贴壁细胞可以检测细胞增殖情况[16，17]。

1.2 卵巢黄体细胞培养

采用妊娠16 d大鼠的黄体或25～30日龄幼年雌性大鼠促排卵后的妊娠黄体，在体外用不同的分离液和消化液分离出黄体细胞，制成悬液在体外培养。加入外源物质和细胞相互作用，观察细胞存活率和测定细胞分泌产物孕酮含量，观察细胞形态学，测定环磷酸腺苷、DNA 或蛋白质含量、激素受体等[18，19]。该方法可以用来初步筛选影响黄体细胞生长和发育的外源物质，和大鼠卵巢颗粒细胞培养方法类似，缺陷是黄体细胞原代培养比颗粒细胞培养困难，培养时间也较短。

1.3 腔前卵泡培养

大、小鼠腔前卵泡的发育过程中， 其组成部分在各个发育阶段都有可能对外源物质的损伤敏感， 这些将影响卵泡的发育， 还可能引起卵母细胞减数分裂异常、受精失败或者胚胎发育不良。通过卵泡形态学、生物功能和卵子的发生来检测外源物质对其影响， 用于对卵巢功能有抑制作用或激活作用的外源物质的筛查， 也可用于外源物质对卵泡发育和受精能力的作用机制研究。卵泡培养方法目前主要有二维培养(贴壁卵泡培养)和完整三维结构(球状结构)培养两种类型。方法是从12～14 日龄的雌性大、小鼠卵巢中机械性分离腔前卵泡(120～170 μm)进行体外培养， 检测指标主要是： 卵泡的存活、卵泡的生长、卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)的排出比率、卵母细胞的数量和成熟度-生发泡(germinal vesicle，GV)、生发泡破裂(germinal vesicle breakdown， GVBD)和第一极体(polar body， PB)的形成率、性激素的水平如雄烯二酮、睾酮、雌二醇和孕酮水平[20-22]。

1.4 卵巢器官培养

取大、小鼠胚胎卵巢或出生后大、小鼠卵巢器官进行培养，也可对卵巢通过未损伤的脉管系统进行培养基灌流培养，主要用于卵巢内血流作用、静止期卵泡的启动、卵泡生长发育、排卵和卵泡获得产生类固醇激素能力的研究[23]。缺陷在于体外培养时间短，不利于长期培养。

1.4.1 卵巢灌流培养系统 卵巢体外灌流培养是将手术分离后的卵巢放置于循环灌流系统中灌流培养，灌流系统内添加不同培养基，通过未损伤的脉管系统进行灌流，观察培养后卵巢组织的生长并进行生物化学分析，也可检测卵泡发育、排卵和类固醇激素的合成。主要用于研究外源物质对卵巢内卵泡发育和排卵的影响，便于从整体水平上发现毒性靶点。以妊娠13 d 小鼠胚胎卵巢为研究材料，建立小鼠胚胎卵巢器官体外无血清培养模型。胚胎卵巢培养分两步： 首先在体积分数2%胎牛血清条件下胚胎卵巢进行贴壁培养5 d， 再以胰岛素硒添加剂(insulin transferring selenium， ITS)和胎球蛋白继续培养14 d(相当于到产后13 d)，经过19 d 的培养胚胎卵巢中有大量原始卵母细胞开始生长， 培养中后期胚胎卵巢中出现许多早期次级卵泡。新生啮齿动物卵巢培养涉及从初生到出生20 d 的整个卵巢培养，多数的卵巢在体外培养8 d后， 将卵丘复合体分离再培养14 d。这种培养体系可用于毒理学研究，找出可能干扰这些进程的潜在危险的外源物质[24]。

1.4.2 卵巢皮质薄片培养 卵巢组织切片悬浮培养，增加了气体和营养物质的扩散，减少卵巢组织的坏死[25，26]。通过组织切碎机将卵巢皮质层切成100 μm厚的薄片置于培养液中培养，组织培养到一定阶段后再从薄片中分离腔前卵泡，进一步在体外发育为可以排卵、受精的卵母细胞。如有研究[27]将成年人的卵巢切片在体外与环磷酰胺、顺铂等化疗药物以及促性腺激素释放激素激动剂共培养，表明促性腺激素释放激素激动剂对于化疗药物引起的卵巢损失并无保护作用。还有研究[28，29]将妊娠12.5 d 小鼠胚胎时期卵巢(除去中肾)切片在体外培养28 d天用于分离卵母细胞做分析或切片在体外培养8 d，用于观察生殖细胞密度。目前已证明，利用器官培养或皮质薄片培养能够成功地在体外启动原始卵泡的生长，它既保留了卵巢整个器官培养时的优点，又克服了其缺点，它可以去除卵巢髓质分泌的抑制因子对卵母细胞在体发育的抑制作用，从而在体外同时获得大量发育程度相近的卵母细胞。该方法可以探究在体内很难评估的一些细胞因子对卵泡发育的影响，也可以研究卵巢在体外的类固醇激素合成能力及其影响因素。卵巢皮质薄片培养技术是卵巢器官培养的一个有力补充。

1.5 芳香化酶测试

芳香化酶在卵巢和胎盘中活性很高，具有将雄性激素转化为雌性激素的功能，不少杀虫剂、黄体类似物和芳香化酶抑制剂都有抑制芳香化酶的活性。体外芳香化酶检测通过测量芳香化酶对标记的雄烯二酮的代谢能力，用于筛选外源物质是否干扰芳香化酶的活性。目前有两种体外检测系统，分别是JEG-3 和JAR 绒毛癌细胞系[30-32]。此外，还可以运用人类胎盘微粒体的体外亚细胞手段检测芳香化酶的活性。

1.6 雌激素受体结合试验

许多环境化合物虽然对人体不具有明显毒性，但却能干扰人的内分泌系统。这种内分泌干扰能够破坏几乎所有的脊椎动物的内分泌系统。雌激素主要通过雌激素受体(estrogen receptors， ERs)来介导细胞增殖、分化和内稳态的生物学作用。不同靶组织中的细胞质膜、线粒体、细胞核上的ERs 有着相似的调节功能， 但也存在一定的差异[33]。雌激素受体结合试验用于检测能够与雌二醇受体结合的外源物质。通过定量检测外源物质和17β-雌二醇与ERs的竞争性结合能力， 检测受试物是否能与ERs结合发挥雌激素作用或干扰正常雌激素活性[34]。如应用雌激素竞争性受体结合试验检测乐果、乙酰甲胺磷、久效磷、马拉硫磷、对硫磷和对氧磷6 种有机磷农药的雌激素样活性，结果显示这6 种有机磷农药的结合率均未下降到50%，说明这6 种有机磷农药不与大鼠子宫雌激素受体的位点结合[35]。

1.7 雌二醇受体转录检测

当外源物质干扰内分泌系统时可能会引起发育异常、生育障碍、患癌风险增加、免疫系统及神经系统功能异常等后果，其中最常受到影响的是性激素水平。雌二醇受体是一个诱导靶基因转录的转录因子，将雌二醇受体调控的DNA 序列与易测的报告基因连接，可以直接对雌激素类外源物质进行筛选。体外雌二醇受体转录检测主要用于鉴定在体内能够影响雌二醇活性的激动剂或拮抗剂。如293T、HSC-T6、MCF-7 等细胞均可被转染成为检测细胞[36-38]。OECD 建议使用来自人的宫颈癌并经稳定转染的细胞系hERa-Hela-9903，细胞暴露于非细胞毒性浓度的受试物20～24 h 以诱发报告基因的产生，同时检测4 种性激素水平，包括强雌激素(17β- 雌二醇）、弱雌激素(17β- 雌二醇)、极弱雌激素(17-β-甲基睾酮)和阴性对照(皮质甾酮)。如果诱发的最高反应相当于或者超过阳性对照(1 nmol/L 17-β-雌二醇)反应的10%， 可以判定为阳性物质(Test No.455)[39]。

1.8 子宫颈/内膜上皮细胞体外试验

在基质中培养子宫颈/内膜上皮细胞，模拟体内环境，观察细胞的形态学变化[40，41]，用CCK-8法和基因表达技术研究外源物质对子宫颈/内膜上皮细胞增殖和分化的影响[42]。类性激素外源物质会使子宫颈/内膜上皮细胞产生与内源性类固醇相似的反应，调节其功能。

2 胚胎组织和细胞培养

1990年代末， ECVAM推荐有效性较高的3个体外胚胎发育毒性筛选试验作为体外筛选外源毒性物质的首选方法，即体外全胚胎培养试验(WEC)、胚胎细胞微团培养试验(MM)和胚胎干细胞试验(EST)[11]。根据体内发育毒性的数据，将外源物质分为3 类： 无胚胎毒性、弱胚胎毒性和强胚胎毒性。试验系统通过建立标准操作规程来达到标准化，结果显示出良好的预测能力和重现性[43]。

2.1 WEC

胚胎毒性通常是指外源物质对胚胎选择性毒性作用，表现为妊娠着床前早期阶段或着床后阶段胚胎的丢失，或出生前引发的在胎儿期观察到的任何毒性表现。胚胎毒性虽然是在宫内引发，但表现在出生前或出生后发育过程中，主要包括妊娠卵枯萎、胎死宫内、胎儿生长受限、功能缺陷和畸形等。体外试验具有简便、经济、试验周期短、试验条件可控、剂量-反应关系易测和排除母体干扰等优点，已广泛应用于胚胎毒性的筛选和致畸机制的研究。体外全胚胎培养方法在致畸因素的筛选、致畸作用机制的探讨及发育生物学等研究中均有广泛的应用价值，是一种将动物的完整胚胎移植到体外进行培养的实验技术。该方法1 9 3 0 年代由Nicholas 等[44]提出， 1970 年代由New 等[45]通过不断改进发展成熟和完善，该法主要模型动物有小鼠、大鼠和兔等。大鼠全胚胎培养是从妊娠9～10 d 大鼠子宫取出胚胎，剥去胎膜，放入培养液中加入受试物，在含O2、CO2和N2环境中旋转培养，观察胚胎发育情况，记录胚胎存活，检测胚芽、卵黄囊直径、体节和体长等情况。以胚胎的心跳和血液循环是否作为胚胎存活的指标； 以卵黄囊直径、颅臀长和头长、体节数和胚胎重作为配套生长发育的指标； 根据Brown 评分对器官形态分化作出评价，包括17 项形态指标： 卵黄囊血管、尿囊、胚胎体位、心脏、前后神经管、前脑、中脑、后脑、听觉系统、视觉系统、嗅觉系统、鳃弓、上颌突、前肢芽、后肢芽和体节数。然后按各个组织器官形态分化过程分为5 个层次，分别赋予0～4 分，各组织器官累积得分为总得分。总得分越低，说明胚胎形态发育越不正常，即受试物的发育毒性作用程度越高[46]。该方法可用于筛查外源物质的发育毒性、探讨其剂量反应关系和作用机制。用带脏层卵黄囊的妊娠10.5 d 的兔胚胎在含100%氧气密封瓶中体外旋转培养，存活12 h； 用妊娠10 d 的日本大耳白兔胚胎在体外培养了48 h，形成了兔着床后全胚胎培养方法，评估体系与大鼠全胚胎培养方法类似[47]。

2.2 MM

微团培养是1980 年代由Flint[48]建立，并经Renault 等[49]加以改善的体外培养试验系统，已广泛应用于胚胎毒物筛检。其理论基础是： 一些毒性物质影响靶器官或靶组织细胞的分化、增殖、迁移及基质的改变，而这些改变可通过未分化细胞的体外培养表现出来，从而根据培养细胞集落形成数量、细胞形态、基质变化和超微结构的变化评价化学物质的毒性作用及其机制[11]。胚胎肢芽细胞可取自鸡、兔或大、小鼠，细胞一般分离自器官形成中期胚胎的肢体或头部组织，制成单细胞悬液后，以高密度接种培养，通过分析外源物质暴露后细胞分化情况，对确定的毒理学终点进行检测。采用微团培养观察不同浓度的双酚A(0～50 mg/L)对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响，结果显示双酚A对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞的增殖和分化均有抑制作用，表现为染毒组肢芽细胞集落形成数量减少，细胞毒性试验吸光度值下降， 并呈现出明显的剂量-反应关系[50]。采用妊娠13 d 小鼠胚胎后肢芽制成细胞悬液， 微团培养检测续断水煎液对小鼠胚胎肢芽细胞增殖，分化和凋亡的影响，结果表明续断水煎液对胚胎肢芽细胞无毒性作用， 还能促进肢芽细胞的增殖和分化，抑制肢芽细胞的凋亡[51]。采用三维技术建立小鼠胚胎中脑体外培养系统， 在2个小鼠品系中进行验证微团培养。从妊娠11 d 的C57BL/6 小鼠胚胎或妊娠12 d 的A/J 小鼠胚胎中分离脑细胞培养，高密度微团体外培养22 d 进行比较， 两种小鼠微团系统的蛋白表达模式相似。这种研究早期神经发生的3D 培养方法，可应用于体外神经发育毒性的研究[11]。

2.3 EST

外源物质对于生殖细胞或者早期胚胎的影响将会引起不孕或者种植前胚胎的发育异常，进而引起胚胎毒性或者是后代的畸形，胚胎干细胞(ES)由于其无限增殖及多向分化的潜能而作为研究体外胚胎毒性的细胞模型得到广泛应用，以ES 为基础的EST是2003年获得ECVAM认可的胚胎毒性评价的体外替代方法，但该实验方法的快速性和准确性存在一定局限性，目前该细胞模型的研究主要集中于快速性和准确性的优化[12]。方法参照ECVAM 提供的EST 操作程序，采用小鼠ES E14TG2a 和成纤维细胞3T3 细胞，或者分别以小鼠ES、人ES(hES)、人诱导多能干细胞为试验载体(hiPS)筛选外源物质对其影响[52-53]。

3 乳腺上皮细胞体外试验方法

乳腺最主要的功能就是泌乳，乳腺上皮细胞是乳腺中唯一具有分泌功能的细胞。体外培养的乳腺上皮细胞在研究乳腺的发育机制、乳汁的分泌机制、乳腺生物反应器的构建和乳腺癌发生的研究中均有应用。与乳腺发育及泌乳相关的激素有三类。第一类是性激素： 包括雌激素、孕激素、催乳素和催产素； 第二类是与新陈代谢有关的激素： 包括生长激素、类固醇激素、甲状腺激素和胰岛素； 第三类是乳腺激素： 泌乳刺激素、甲状旁腺激素相关肽和瘦素。雌激素和孕酮可以刺激单层小鼠乳腺上皮细胞酪蛋白的合成，单独用雌激素可以促进小鼠乳腺合成酪蛋白及乳糖[54，55]。乳腺上皮细胞可取自兔、大鼠、小鼠、牛和人[56，57]。外源毒性物质与乳腺上皮细胞共孵育，观察对其生长增殖和相关蛋白的影响，通过该方法也容易找到相应的保护物质，如茶多酚可保护牛乳腺上皮细胞免受过氧化氢诱导的氧化损伤[57]。

4 展望

现行完整的生殖发育毒性研究，包括二代生殖毒性在内，大约需要5 000 多只动物。整体动物雌性生殖发育毒性研究方法仍是评价外源毒性物质的主要方法，特别是药物生殖发育毒性评估，但其存在不敏感、周期长、所需受试样品量多，特别是由于体内实验生殖功能主要是以与生殖后果有关的参数作为基础，因此难以揭示毒作用位点和毒作用机制。而且，成年动物雌性卵巢是由不同发育阶段各种卵泡群组成的，体内试验不易发现不同阶段的卵泡毒性。而雌性生殖发育毒性体外培养技术可以模拟生殖发育过程中的各个环节，对于优化和减少体内生殖毒性研究中动物的使用显示出巨大潜力，并且便于精准确定毒性靶器官和探索毒性机制。但体外试验也存在代谢能力和人体有差异、缺乏毒代动力学过程、种属外推、体细胞与生殖细胞敏感度不同等问题。任何一种体外方法无法全面模拟外源物质在体内对生殖发育系统影响的全过程，尚不能完全替代目前生殖发育毒性试验常用的整体动物实验。现代生殖发育毒理学研究不断引入新的体外培养技术，由传统的整体动物实验逐步发展到体外细胞和分子水平。三维培养系统的建立使相关培养方式更接近机体本身[58，59]，随着各个替代优化方法不断被验证实施，雌性生殖发育毒性体外方法学研究将得到新的发展和突破。