响应面法优化超声波辅助法提取稠李子多酚的工艺研究

齐泊霖，高尊，谢春阳

（吉林农业大学，吉林长春130118）

稠李子，又名臭李子，拉丁学名Rhamnus davurica Pall.，被子植物门，双子叶植物纲，鼠李科，鼠李种。稠李子主要分布在我国东北部和俄罗斯的西伯利亚地区，朝鲜和蒙古也有少量分布。成熟期为8月～9月，稠李子种子可炼油，果肉可入药属于药食兼备的野生浆果。

稠李子含有植物多酚[1-3]，植物多酚是多羟基酚类化合物的总称，具有清除自由基、抗氧化、抗辐射、抗过敏、预防人体衰老、降血糖降血脂的作用[4-5]。植物多酚目前应用于食品、药品、保健品、美容产品、抗氧化剂等各个行业，受到各界学者的青睐[6]。

常见的多酚提取方法有1）溶剂提取：将所选的溶剂加入到待提取的固相或液相中，使其混合，从而将其中一种或多种多酚类物质溶出，这类方法统称为溶剂萃取法。该方法工艺简单，但用的溶剂剂量十分大，耗费时间长，操作要求严格[7]。2）超声波辅助法：利用超声波产生的微气核、热效应以及空化效应，使细胞内物质加速释放，溶解。其优点在于操作简单快捷，提取时间短，不会破坏提取物的结构[8]。3）生物酶解提取法：选择相应的纤维素酶、果胶酶进行水解，从而破坏细胞壁结构，加快细胞内成分溶解[9]。4）微波辅助提取法：在微波过程中，微波辐射产生大量热量，导致细胞壁破坏，从而加速细胞内成分释放，但缺点是有可能破坏多酚类物质[10]。

本试验以超声波辅助法提取稠李子中的多酚，以稠李子多酚的提取量为试验指标，对超声时间、超声功率、液料比、乙醇浓度4个因素进行单因素试验，在单因素的基础上选取效果最佳的3个取值，借助试验设计软件Design Expert 8.0采用Box-Behnken设计法对影响超声波辅助法提取稠李子中多酚提取量的4个关键因素超声时间、超声功率、液料比、乙醇浓度进行优化，建立并验证相关的工艺数学模型，得出超声波辅助提取稠李子多酚的最佳的提取工艺，旨在为稠李子多酚提取及稠李子多酚产品的深度开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稠李子：采购于大兴安岭；无水碳酸钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：北京化工厂；福林-酚试剂：上海荔达生物科技有限公司；没食子酸（分析纯）：天津市光复精细化工厂。

1.2 仪器与设备

SY-1000E超声波细胞粉碎机：北京弘祥隆生物技术有限公司；T6型紫外分光光度计：上海五相仪器仪表有限公司；HH-4A型号数字显示恒温水浴锅：常州普天仪器；YP4002电子天平：上海佑科仪表有限公司；LXJ-IIB型离心机：上海安亨科学仪器厂；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；LGJ压盖型冻干机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制备

本试验运用福林-酚比色法测定稠李子中的多酚含量。以没食子酸计，在760 nm处测定吸光值，根据吸光值的大小与没食子酸浓度的大小成正相关的关系，制作没食子酸标准曲线[11]。

1.3.2 结果计算

式中：M为稠李子样品中多酚的含量，mg/g；X为在稠李子多酚含量标准曲线中根据所测吸光值得出的稠李子多酚溶液的质量浓度，μg/mL；m为稠李子样品的质量，g；V为稠李子样品定容的体积，mL；A为吸光值；1 000为样品稀释倍数[12]。

1.3.3 稠李子粗多酚的提取工艺

洗净→去核→匀浆→超声波辅助提取→离心→上清液→浓缩→冷冻→冻干

1.3.4 稠李子多酚提取的单因素试验

1.3.4.1 超声时间对稠李子多酚提取量的影响

准确称取稠李子匀浆10 g，将超声波功率设定为600 W，溶剂乙醇的浓度固定为50%，液料比的比值固定为 15 ∶1（mL/g），考虑超声波处理时间为 10、20、30、40、50 min时，对稠李子多酚提取量的影响。

1.3.4.2 超声功率对稠李子多酚提取量的影响

准确称取稠李子匀浆10 g，将超声时间固定为30 min，溶剂乙醇的浓度固定为50%，液料比的比值固定为 15∶1（mL/g），考虑超声波功率为 200、400、600、800、1 000 W时，对稠李子多酚提取量的影响。

1.3.4.3 液料比对稠李子多酚提取量的影响

准确称取稠李子匀浆10 g，将超声时间固定为30 min，超声波功率设定为600 W，溶剂乙醇的浓度固定为 50%，考虑液料比的比值为5∶1、10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）时，对稠李子多酚提取量的影响。

1.3.4.4 乙醇浓度对稠李子多酚提取量的影响

准确称取稠李子匀浆10 g，将超声时间固定为30 min，超声波功率设定为600 W，液料比的比值固定为 15∶1（mL/g），考虑溶剂乙醇的浓度为 30%、40%、50%、60%、70%时，对稠李子多酚提取量的影响。

1.3.5 响应面试验设计

在上述单因素试验的基础上，利用响应面法设计超声波辅助法提取稠李子多酚的试验方法，选取超声时间、超声功率、液料比、溶剂乙醇浓度为影响稠李子多酚的提取优化的因素，以稠李子多酚提取量（M）作为试验设计的响应值，借助试验设计软件Design Expert（Version8.0），采用 Box-Behnken 设计法，借助四因素三水平的试验设计方法来确定超声波辅助法提取稠李子多酚的最佳工艺参数。主要的考察要素（自变量）是：超声时间、超声功率、液料比、溶剂乙醇浓度，分别用 A、B、C、D 表示，用-1、0、1分别代表自变量的低、中、高水平。试验设计因素编码及水平见表1[13]。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 Variables and levels in response surface design

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

采用福林-酚比色法，绘制的没食子酸标准曲线见图 1。回归方程：Y=0.131 7x-0.067 4，R2=0.997 2。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 超声时间对稠李子多酚提取量的影响

超声时间对稠李子多酚提取量的影响如图2所示。

将毛竹不同密度、不同施肥条件下的毛竹胸径增长率(增长量与未施肥前胸径比值)进行双因素方差分析，结果显示：F密度=0.090，Sig.=0.769；F肥料=2.250，Sig.=0.142。说明在不同密度条件中不同肥料所产生的增长率没有显著差异。这与郭志坚研究[2]的结果相似。

图2 超声时间对稠李子多酚提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

超声时间在10 min～40 min之间，稠李子多酚的提取量随着时间的增加而增加，当超声时间为40 min时，多酚提取量最高为5.794 mg/g，当超声时间高于40 min时，稠李子多酚提取量开始有下降的趋势。超声时间过长，多酚提取量会受到影响。因此，超声时间应控制在40 min左右[14]。

2.2.2 超声功率对稠李子多酚提取量的影响

超声功率对稠李子多酚提取量的影响如图3所示。

图3 超声功率对稠李子多酚提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

声功率在200 W～600 W之间时，稠李子多酚提取量逐渐上升，当功率达到600 W时，稠李子多酚提取量达到最大5.665 mg/g。当超声功率超过600 W时，稠李子多酚提取量会呈大幅度下降趋势。可能的原因是超声功率过高，其导致的热效应与机械效应会使多酚类物质结构被破坏。因此，超声功率应该控制在600 W左右[15]。

2.2.3 液料比对稠李子多酚提取量的影响

液料比对稠李子多酚提取量的影响如图4所示。

图4 液料比对稠李子多酚提取量的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

液料比从 5 ∶1（mL/g）增加到 15 ∶1（mL/g），稠李子多酚提取量有着明显的提升，当液料比增加到15 ∶1（mL/g）时，多酚提取量达到 5.172 mg/g，稠李子多酚提取量基本趋于平稳，此时再增加液料比稠李子多酚提取量提升效果不显著（P＞0.05），还会增加提取成本，因此，液料比应控制在 15 ∶1（mL/g）左右[16]。

2.2.4 乙醇浓度对稠李子多酚提取量的影响

乙醇浓度对稠李子多酚提取量的影响如图5所示。

乙醇浓度在30%～50%之间，稠李子多酚提取量逐渐上升，当乙醇浓度达到50%时，稠李子多酚提取量达到5.624 mg/g，乙醇浓度超过50%后，稠李子多酚提取量增加趋势不明显（P＞0.05），基本趋于平稳，并且随着乙醇浓度的增大，也会使其他杂质溶出，还会增加试验成本。因此，乙醇浓度应控制在50%左右。

图5 乙醇浓度对稠李子多酚提取量的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

2.3 响应面法优化结果

2.3.1 模型方程的建立与显著性检验

通过响应面法设计得出稠李子多酚提取量的数值，如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计与数据分析Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

续表2 Box-Behnken试验设计与数据分析Continue table 2 Response surface design arrangement and experimental results

方差分析结果见表3。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

通过表3可知F值为28.72，P值＜0.000 1，表示该模型为高度的显著。从表3的F值可判断出，各因素对稠李子多酚提取量影响的大小顺序依次为：超声功率＞超声时间＞乙醇浓度＞液料比[17]。稠李子多酚的提取量，对自变量超声功率、超声时间、液料比、乙醇浓度的二次多项回归方程为：M=6.01-0.69×A+0.40×B+0.20×C+0.15×D+0.24×A×B-0.081×A×C+0.033×A×D-0.034×B×C-0.31×B×D-0.080×C×D-1.15×A2-0.63×B2-0.69×C2-0.59×D2。回归决定系数R2=0.966 3，校正决定系数R2Adj=0.932 7（0.932 7＞0.80） 以及变异系数（CV）为0.820 0，说明此模型可以解释其中93.27%变化的响应值，仅有总变异的6.73%变化无法用此模型解释，则该模型的拟合度较好，具有统计学意义，可以用来对超声波辅助法提取稠李子多酚的工艺研究进行初步分析和预测，通过响应面法分析后可看出：AB、AC、AD、BC、BD、CD之间的关系不能用简单的线性关系来描述，此二次多项回归方程能较好地描述各个自变量与响应值之间的真实关系，最好的提取工艺条件也可以用其来确定。由此得到最优提取工艺为：稠李子多酚的提取量为6.17 mg/g；最优的超声波处理功率为554.1 W，超声波处理时间为42.4 min，液料比为15.2 ∶1（mL/g），乙醇浓度为 51.5%[18]。

2.3.2 稠李子多酚提取量的响应面分析

利用Design Expert（Version8.0）软件，得到相应的二次回归方程的等高线及其响应面图。根据模型所做的响应曲面及其相应的等高线图可评估试验因素对稠李子多酚提取量的互相作用，以及确定每个自变量的最优水平范围。交互效应的强弱可由等高线的形状反映，若两因素交互作用显著则显示为椭圆形，若表示成圆形，则两因素交互作用可忽略[19]。超声功率与超声时间交互作用对稠李子多酚提取量的影响结果见图6。

图6 超声功率与超声时间交互作用对稠李子多酚提取量的影响Fig.6 Effect of iltrasonic power value of interaction with the iltrasonic time on the yiled of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

由图6可以看出，超声波功率与超声波处理时间的相互作用，对稠李子多酚提取量的影响，当超声波功率与超声波处理时间超过一定值时，稠李子多酚的提取量会有所下降，可能是由于较高的超声波功率和长时间的超声波处理时间会对已经溶出多酚类物质的结构产生破坏，从而使稠李子多酚的提取量下降。由表3可知AB的P值小于0.05，为显著水平，说明AB的交互作用对多酚的提取量有着较为重要的影响[20]。

液料比与超声时间交互作用对稠李子多酚提取量的影响见图7。

图7 液料比与超声时间交互作用对稠李子多酚提取量的影响Fig.7 Effect of liquid-to-solid ratio value of interaction with the iltrasonic time on the yiled of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

由图7可以看出，液料比与超声波处理时间的相互作用会对稠李子多酚的提取量产生影响，当液料比与超声波处理时间超过一定值时，会使稠李子多酚的提取量会下降，由于较高的液料比会使稠李子中的杂质溶出，并且长时间的超声波处理时间会对已经溶出多酚类物质的结构产生破坏，从而使稠李子多酚的提取量下降。由表3可知BD的P值小于0.05，为显著水平，说明BD的交互作用对多酚的提取量有着较为重要的影响。

根据Design Expert（Version8.0）软件所提供的预测提取工艺参数为超声时间42.4 min，超声功率544.1 W，液料比 15.2 ∶1（mL/g），乙醇浓度为 51.5%，稠李子的多酚提取量为6.27 mg/g，但考虑试验仪器实际情况，故将超声时间调整为43 min，超声功率为550 W，液料比为15∶1（mL/g），乙醇浓度为52%，在此条件下进行3次重复试验，稠李子多酚提取量为（6.23±0.18）mg/g，与预测值基本吻合，说明在此4个条件下的模型对于稠李子多酚提取量能够进行较准确的分析，该优化工艺条件较为可靠。

3 结论

本试验应用超声波辅助法提取稠李子多酚，以稠李子多酚提取量为试验指标，得出超声波辅助法提取稠李子多酚的最佳条件为：超声时间43 min，超声功率为550 W，液料比为15∶1（mL/g），乙醇浓度为52%，稠李子多酚提取量为（6.23±0.18）mg/g。