蝴蝶荚蒾花中总黄酮提取工艺研究

（渭南师范学院农商学院，陕西省煤基低碳醇转化工程研究中心，陕西渭南714099）

蝴蝶荚蒾（Viburnum plicatum）为忍冬科荚蒾属落叶灌木，别名蝴蝶戏珠花、绣球花。其花色为白色或乳白色，花序边缘有4～6朵不育花，极似群蝶飞舞而得名[1]。其果实多为倒卵形，常由绿色变为红色又转为黑色。花期4月～5月，观果期7月下旬至9月下旬，观花观果都具极高的观赏价值[2-3]。目前关于荚蒾属的报道主要集中在其栽培及观赏价值的研究，而以蝴蝶荚蒾花为材料提取黄酮类色素的研究鲜有报道。黄酮类色素是一种生物活性物质，具有较广泛的药用价值，其抗氧化性、抗衰老、抗癌、降低血糖血脂、降血压等作用，可用来治疗心脑血管疾病。此外，还具有消炎、杀菌、镇痛等特点，对消化性溃疡有保护作用[4-6]。本试验以蝴蝶荚蒾花为材料，采用单因素试验和正交试验相结合提取蝴蝶荚蒾花总黄酮，以期为更好地开发利用蝴蝶荚蒾花提供试验依据，为缓解药用植物相对资源不足、开发可持续利用的药用资源另辟蹊径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为蝴蝶荚蒾花，采自西安植物园。

芦丁标准品：中国药品生物制品检定所，纯度98%；乙醇、NaNO2、Al（NO3）3·9H2O、NaOH（分析纯）：上海生化制品有限公司。

1.2 仪器

755B紫外可见分光光度计、PHS-25雷磁pH计：上海精密科学仪器有限公司；MC京制电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HH-8数字恒温水浴锅：国华电器有限公司；Anke DI-4000B离心机：上海安亭科学仪器厂；DHG-9101恒温鼓风干燥箱：杭州浣熊仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芦丁对照品标准曲线的制作

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定标准曲线[7]。精确称取20 mg的芦丁对照品（105℃干燥至恒重），用60%的乙醇溶解定容100 mL的容量瓶中，得到浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液，将其作为储备液备用。精密量取芦丁对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分别置于 25 mL 的容量瓶中，加质量分数5%的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加入质量分数10%的硝酸铝1 mL混匀，放置6 min后加入10 mL质量分数4%的氢氧化钠，再加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm波长处测定吸光值（以不加芦丁的空白管为对照）。以芦丁质量浓度为横坐标（x），吸光值A为纵坐标（y），绘制标准曲线。

1.3.2 材料处理提取步骤

将采摘的蝴蝶荚蒾花，置于恒温鼓风干燥箱中，45℃温度下烘干至恒重，用研钵研碎备用。

称取研碎的蝴蝶荚蒾花0.1 g置于25 mL的容量瓶中，加入一定体积分数的乙醇提取，离心取上清，加蒸馏水定容至刻度。精确吸取2.5 mL样品，加入质量分数为5%的NaNO21 mL，混匀，放置6 min，加质量分数为10%的Al（NO3）31mL混匀，放置6 min，再加质量分数为4%的NaOH 10 mL，立即加蒸馏水定容至25 mL，摇匀放置15 min，于最大吸收波长处测定吸光度；根据标准曲线计算花中总黄酮含量，每个样品重复3次求平均值。根据回归方程计算提取物中黄酮的总量，并按下式计算蝴蝶荚蒾花瓣总黄酮的提取率。

1.3.3 单因素试验

按照1.3.2中的方法进行单因素提取试验，研究不同固液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间分别对蝴蝶荚蒾花总黄酮得率的影响。

准确称取0.1 g蝴蝶荚蒾花粉5份，分别以1：10、1：15、1：20、1：25、1：30（g/mL）为固液比，加入 35%的乙醇，在50℃水浴中浸提30 min，测定固液比对蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响。

精确称取0.1 g蝴蝶荚蒾花粉5份，分别以体积分数为30%、35%、40%、50%、60%的乙醇浸提剂，以1∶25（g/mL）的固液比，在50℃的水浴锅中浸提30 min，测定乙醇浓度对蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响。

准确称取0.1 g蝴蝶荚蒾花粉5份，以1∶25（g/mL）的固液比，加入 35%的乙醇，分别在 40、50、60、70、80℃温度下浸提30 min，测定不同温度对蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响。

准确称取 0.1g蝴蝶荚蒾花粉 5份，以 1：25（g/mL）的固液比，加入 35%的乙醇，分别以 10、20、30、60、90min的时间，在50℃水浴锅中浸提，以测定不同提取时间对蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响。

1.3.4 正交试验

在参考资料和前期预试验的基础上，考察固液比、乙醇浓度、提取时间以及提取温度4个因素对提取率的影响，选取L9（34）正交设计[8-9]，得到最佳提取条件，以提高总黄酮的产量，试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels design of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 标准曲线

按照1.3.1的方法，芦丁标准溶液的吸光值和其浓度的关系见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Calibration curve of rutin

以吸光度值A对芦丁标准曲线浓度C（mg/mL）作标准曲线，其标准曲线方程为A=11.505C+0.019 9，其中 R2为 0.998 8。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 不同固液比对蝴蝶荚蒾花总黄酮固液比对黄酮提取率的影响见图2。

图2 固液比对黄酮提取率的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate

如图 2 所示，当固液比在 1∶10（g/mL）到 1∶20（g/mL）之间时，黄酮提取率随固液比的增大而增大，在固液比为1∶20（g/mL）时达到最大值，随后，提取率随固液比的增大反而减小。其原因可能是在一定的固液比范围内，蝴蝶荚蒾花细胞中的黄酮类物质溶出随固液比的增大而增大，在一定比例的固液比时，黄酮类化合物已基本溶出，此时再提高固液比不会促进黄酮类物质的溶出，反而会增大杂质的溶出从而影响提取结果，故选取固液比为 1∶20（g/mL）最合适。

2.2.2 不同乙醇浓度对蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响

不同乙醇浓度的浸提效果如图3所示。

图3 乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction rate

在乙醇浓度达到30%到35%之间时，总黄酮提取率随浓度增加而增加，在浓度为35%时，总黄酮提取率达到最大值，然而在此基础上再增加乙醇浓度总黄酮提取率反而下降，尤其是酒精浓度从40%上升到50%时，总黄酮提取率下降特别明显，从50%～60%下降速度变慢。可能是在一定乙醇浓度范围内，蝴蝶荚蒾花黄酮类色素随乙醇浓度的增加溶出速度增加，到35%时溶出速度达到平衡。随着乙醇浓度的继续增加，提取液中的一些叶绿素及其它色素和一些脂溶性物质被提取出来，干扰因素也会随之增加，从而影响黄酮类色素的溶出。因此，为了充分提取黄酮，故选择35%的乙醇浓度较好。

2.2.3 不同提取温度对蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响

提取结果如图4所示。

图4 提取温度对黄酮提取率的影响Fig.4 Effects of extracaug temperature on extraction rate

随着温度的上升，黄酮类化合物的提取率也随之上升，原因是温度上升可以促进分子运动，黄酮类化合物可以更容易从细胞质中分离出来，温度的升高可以促进提取率的升高，但在50℃后温度的升高反而使得黄酮类化合物的提取率降低，可能是因为温度过高时，一些黄酮类化合物遭到破坏，另外，温度过高会导致提取液中杂质含量增高，并且过高的温度会使蝴蝶荚蒾花中的酚类物质发生氧化褐变反应，使产品颜色变深，影响产品质量，因此选择提取温度为50℃。

2.2.4 不同提取时间蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率的影响不同时间的浸提效果如图5所示。

图5 时间对黄酮提取率的影响Fig.5 Effects of extracang time on extraction rate

蝴蝶荚蒾花中总黄酮的提取率随时间的延长先增加后下降至逐渐平缓，其提取率在30 min时达到最大，但如果提取时间过长，可能会使乙醇溶剂挥发，从而导致乙醇浓度下降，因此影响了黄酮类化合物的提取率。所以选择提取的时间为30 min。

2.3 正交法对黄酮提取工艺的优化

2.3.1 正交法回归模型的建立与分析

正交试验分析表见表2。

极差分析得到的平均提取率最高水平组合方案为 A3B3C3D1，即固液比 1∶25（g/mL）、乙醇浓度 40%、提取温度60℃、时间10 min。根据正交试验的结果可知，4种因素及其因素水平对提取率的影响是不同的。从C因素（温度）来看，极差最大，说明温度对提取率的影响最大；从B因素（乙醇浓度）来看，极差最小，说明选取的乙醇浓度对提取率的影响最小。各试验因素之间存在一定的相互作用，对蝴蝶荚蒾花的提取率产生了不同的影响。根据极差R的大小得出对蝴蝶荚蒾花提取率的影响顺序依次为C＞A＞D＞B，即提取温度＞固液比＞提取时间＞乙醇浓度。

表2 正交试验分析表Table 2 Results of orthogonal test

2.3.2 正交试验结果方差分析

方差分析表见表3。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

按A3B3D3D1的条件进行验证试验，结果发现蝴蝶荚蒾花总黄酮提取率平均为9.23%，RSD为1.2%。

通过方差分析可以看出（表3），A、C因素对考察指标有显著性影响。B、D二因素对考察指标无显著性影响（P＞0.05）。

3 结论

通过正交试验，确定4种因素对蝴蝶荚蒾花中黄酮类化合物提取率影响的大小顺序为提取温度＞固液比＞提取时间＞乙醇浓度。蝴蝶荚蒾花中黄酮类化合物提取最适条件为：固液比 1∶25（g/mL），乙醇浓度 40%，提取时间10 min，提取温度60℃，总黄酮提取率平均为9.23%。本研究通过正交试验优选出最佳提取工艺条件，为有效提取蝴蝶荚花中黄酮类化合物提供了试验依据。