微纤维蛋白相关糖蛋白2在结直肠癌组织中的表达变化及意义

陈欢，蔡小旭，刘志清

(三峡大学人民医院·宜昌市第一人民医院，湖北宜昌443000)

微纤维蛋白相关糖蛋白2(MAGP2)是一种相对分子质量为25 kD，主要定位于细胞外基质(ECM)的蛋白，其N端的RGD结构域能够与ECM中的弹性纤维等分子发生交联，调节ECM的结构和功能，介导细胞的黏附和运动[1]。MAGP2是ECM影响细胞内信号转导的关键媒介分子，尤其能在不同类型细胞中特异性地激活或抑制Notch信号通路[1～3]。MAGP2已被证实与多种肿瘤(舌癌、乳腺癌、胆管细胞癌)的发生发展有关[4～8]。结直肠癌(CRC)是消化系统肿瘤主要类型，近年来在我国居民中的发病率逐渐攀升[9]。寻找新的CRC标志物，可能会为CRC提供新的诊治靶点。MAGP2在CRC组织中的表达变化国内外尚未见报道。本研究探索MAGP2在正常结直肠组织和CRC肿瘤组织中的表达差异及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年7月～2018年1月本院病理科留存手术切除的CRC组织及其正常结直肠组织50例份，均经病理检查确诊，术前均未接受放化疗。其中CRC患者男35例、女25例，平均年龄54.2岁，结肠癌取材48例、直肠癌取材12例。对患者进行随访，统计5年生存率。本研究经医院伦理审查委员会批准，并获得豁免知情同意文件。

1.2 CRC组织与正常结直肠组织中MAGP2蛋白表达检测 采用免疫组化法。石蜡切片、脱蜡、水化后，用PBS缓冲液(湖北百奥斯生物科技有限公司)洗2次(每次5 min)，用蒸馏水或PBS缓冲液配置新鲜的3% H2O2，室温封闭5～10 min，用蒸馏水洗3次进行抗原修复。之后再用PBS缓冲液漂洗5 min，滴加山羊血清封闭液(湖北百奥斯生物科技有限公司)，室温封闭20 min，甩去多余液体。一抗(MAGP2抗体，Abcam，1∶1 000)室温孵育1 h。之后吸去一抗，用PBS缓冲液洗3次，每次2 min。用二抗(湖北百奥斯生物科技有限公司)室温孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min，滴加试剂SABC，室温静止20 min。之后PBS缓冲液洗净后用DAB(湖北百奥斯生物科技有限公司)显色。脱水、透明、封闭、镜检。根据染色强度分为强阳性、弱阳性、阴性。强阳性为高表达，弱阳性、阴性为低表达。

1.3 CRC组织与正常结直肠组织中MAGP2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。用TRIzol(Invitrogen)法提取各组细胞总RNA，逆转录获得cDNA(Bio-Rad)。设计并合成目的基因和内参的引物后，使用无RNase 的双蒸水将引物稀释至10 μmol/L，之后建立25 μL 的PCR反应体系：cDNA 4 μL，正向引物(深圳华大基因股份有限公司)1 μL，反向引物(深圳华大基因股份有限公司)1 μL，2×SYBR Green master mix(湖北百奥斯生物科技有限公司)12.5 μL，用无RNase 的双蒸水将反应体系调整至25 μL，上机(Bio-Rad)进行实验。MAGP2正向引物5′-AACTTAAGCTTGGTACATGTCGCTCTTGGGACC-3′，反向引物5′-GCCACTGTGCTGGATTCACAGACCATTGGGTCTC-3′；β-actin正向引物5′-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3′，反向引物5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。PCR反应体系：90 ℃预变性5 min；90 ℃变性15 s，65 ℃退火15 s，75 ℃延伸15 s，40个循环；75 ℃再延伸5 min。数据分析采用2-ΔΔCt法。mRNA相对表达量上调2倍为表达上调[10]。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 7软件。计数资料比较采用χ2检验；预后分析采用Log-rank法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC组织与正常结直肠组织中MAGP2表达比较 CRC组织内MAGP2蛋白定位于ECM，且呈强信号，正常结直肠组织内未见明显MAGP2表达。CRC组织中MAGP2蛋白高表达81.7%(49/60)，低表达18.3%(11/60)；正常结直肠组织中MAGP2蛋白低表达13.3%(8/60)，无高表达。CRC组织中MAGP2蛋白表达与正常结直肠组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。随机选择CRC组织与正常结直肠组织各10例，CRC组织中MAGP2 mRNA表达上调占90%(9/10)。

2.2 MAGP2蛋白高表达与CRC患者临床病理特征的关系 MAGP2蛋白高表达的CRC患者Dukes分期高(P=0.048)、肿瘤分化水平低(P=0.034)、伴淋巴结转移(P=0.036)。见表1。

2.3 MAGP2蛋白表达与CRC患者预后的关系 MAGP2蛋白低表达患者的5年生存率为64%(7/11)，而MAGP2蛋白高表达患者的5年生存率为53%(26/49)，比较差异有统计学意义(P<0.001)。

3 讨论

MAGP2的突变或异常表达与人类多种疾病相关，MAGP2的突变可能影响血管弹性纤维的功能，参与主动脉夹层形成的病理过程[10]；MAGP2在脂肪组织中可能扮演了ECM重塑和炎症调控的角色，参与了肥胖和多种代谢相关疾病的发生[11,12]。

肿瘤微环境可与肿瘤细胞相互作用，为肿瘤细胞增殖和转移提供适合的环境。肿瘤微环境中的ECM被认为是细胞生命活动的动态调节器。ECM通过以下机制影响细胞过程。一方面ECM可调控肿瘤微环境中各类分子配体、生长因子、细胞趋化因子及基质降解酶的浓度和活性[13，14]；另一方面，ECM蛋白质组成和交联决定了肿瘤微环境的物理性质，如结构、刚性等，这影响了肿瘤细胞增殖和转移潜能[15～17]。MAGP2是ECM的重要组分，其可能是CRC的癌基因。既往研究发现，MAGP2在舌癌组织中可激活下游MAPK和AKT信号通路，促进肿瘤细胞的恶性表型[6]；MAGP2在乳腺癌组织中能够调节下游基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、焦点黏附激酶、细胞外调节蛋白激酶等通路或分子，促进肿瘤细胞增殖和转移[4,5]。在CRC组织中，MAGP2也可能介导前述信号通路和分子的激活或表达。Notch是肿瘤组织中常见的异常激活通路，Notch与CRC细胞增殖、转移、血管生成和耐药均有紧密联系[18～21]。虽然目前尚无文献证实肿瘤组织中MAGP2是否可以调控Notch，但鉴于MAGP2具有调节Notch活性的结构域，MAGP2-Notch轴可能在CRC发生发展中具有重要意义。另外，MAGP2在CRC中的癌基因角色也可能与其调控整合素信号通路相关。整合素是一类广泛分布于细胞表面的糖蛋白分子，与胞外基质黏附形成黏着斑，为信号蛋白提供信号传导的结构基础，与肿瘤生长、侵袭和转移等过程密切相关[22，23]。有研究表明，MAGP2在内皮细胞中通过RGD结构域与整合素受体结合，调控其下游分子的激活[1，2]。本研究结果显示，MAGP2蛋白在CRC组织中主要定位于肿瘤间质，其表达高于正常结直肠组织，且其高表达与患者临床病理特征及预后相关，提示MAGP2可能为CRC的诊断标志物和治疗靶点。

表1 MAGP2蛋白高表达与CRC患者临床病理特征的关系(例)

综上所述，MAGP2可能为CRC新的诊断标志物和潜在治疗靶点。其在CRC恶性表型中的功能和作用机制有待于进一步研究阐明。