玉米赤霉烯酮新型生物传感器检测技术研究进展

谭红霞，马良，郭婷，陈露，刘微，谢盛莉

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN，又称ZEA，F-2毒素)，是由不同丝状真菌如禾谷镰刀菌、镰刀菌和镰孢镰刀菌产生的一种非甾体霉菌毒素，是全球玉米、大米、小麦和其他谷物中最常见的真菌毒素之一[1]。ZEN是内分泌干扰分子，对动物和人类有外源性雌激素作用，易导致不孕症、流产以及青春期前女孩儿早熟[2]。此外，ZEN还具有血液毒性、肝毒性、遗传毒性、免疫毒性、基因毒性以及致癌性，ZEN与子宫内膜增生，子宫内膜肿瘤以及宫颈癌有关，国际癌症研究机构已将其列为Ⅲ类致癌物[3]。

ZEN主要污染谷物(例如玉米，大麦，黑麦，小麦和高粱中)，在食用油，香料，牛奶，啤酒，饮用水，早餐麦片，面包，意大利面等中也可以检测到ZEN[4]。研究发现，巴西、欧洲、地中海、亚太地区以及地中海等地区，在大麦、啤酒、高粱、稻谷、食用油等中，ZEN的阳性检出率均高于60%[5-6]。在2012～2014年，中国中部地区的饲料样品的污染水平为90.2%[7]。在2013～2015年间从中国各省收集的饲料原料和全饲料中，ZEN阳性样本的百分比为92.3%[8]。在另一项中国调查中，2016～2017年间不同省份饲料中ZEN的发生率为88%，平均浓度范围为2.3～729.2 μg/kg，其中10.8%的样品超过我国国标规定的限量浓度(60 μg/kg)[9]。ZEN的污染范围较广，可以通过植物来源的食物直接进入人类食物链，间接通过动物来源的食物进入人类食物链[10]。据报道，婴儿和儿童比成年人更容易受到ZEN的影响[11]。为了保护消费者的健康，欧盟限定了食品中ZEN的最高残留量，未加工的玉米中为350 μg/kg，以玉米食物和谷物为基础的婴儿食品中为20 μg/kg[12]。中国的谷物及其制品的最高残留限量为60 μg/kg[13]。为了食品安全和畜牧业的发展，迫切需要探索灵敏、快速和便捷的分析方法来监测食品中威胁人体健康的ZEN。

生物传感器是指以生物成分(DNA，真菌毒素抗体，酶，微生物，细胞，组织等)为敏感元件，经分子识别，发生生物学反应，产生的信号继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电化学、光学、电磁学等信号，再经二次仪表放大输出，便可知道待测物的浓度。通常根据分子识别元件或信号转换方式来对生物传感器分类或命名为：信号传导型生物传感器、分子识别型生物传感器[14]。基于生物传感器的检测技术具有高专一性、高选择性、高灵敏度、便携性和实时分析的性能，在ZEN检测方面具有很好的发展前景。目前，针对检测真菌毒素的生物传感器技术已有较多的研究，主要集中在黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)[15]、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)[16]、脱氧雪腐镰刀烯醇(deoxynivalenol, DON)[17]、ZEN等毒素，其中ZEN的检测是近几年的研究热点之一。本文总结了用于ZEN检测的信号传导型生物传感器(电化学生物传感器、表面增强拉曼散射传感器、表面等离子体共振生物传感器、荧光生物传感器)、分子识别型生物传感器(核酸适配体生物传感器、细胞传感器)，并分析了目前存在的问题和未来研究的趋势。

1 信号传导型生物传感器

1.1 电化学生物传感器

电化学生物传感器通常以电极作为转化元件，ZEN抗体、ZEN适配体、酶等生物分子作为识别元件，将生物分子间特异性识别产生的各种物理、化学等信号转换成电阻、电位、电流或电容等物理形式作为特征检测信号输出，从而实现小麦、饲料、玉米等样品中ZEN的检测[18]。纳米材料放大技术、酶催化放大技术等信号放大策略运用到传感器中是提高ZEN检测的灵敏度最常用的方法。

基于纳米材料放大技术的电化学生物传感器应用的纳米材料主要有碳纳米材料、钯纳米材料、金纳米材料、多壁碳纳米材料等。LIU等[19]利用金银铂纳米粒子的高电子转移速率和介孔碳合适的孔排列和优异的导电性，对玻碳电极进行修饰，建立了电流型免疫传感器，该传感器表现出低检测限(1.7 pg/mL)，宽线性范围(从0.005～15 ng/mL)以及良好的稳定性，重现性和选择性。AFZALI等[20]采用钯纳米颗粒和导电聚合物离子液体组成的聚合物纳米复合材料对玻碳电极进行改性，提高了传感器对ZEN的电催化活性。目前，纳米材料放大技术中多壁碳纳米管是研究较多的纳米材料。AFZALI等[21]利用多壁碳纳米管修饰改性后的碳糊电极，检出限为0.58 ng/mL。RIBERI等[22]利用碳纳米管/聚乙烯亚胺分散体修饰碳网印刷电极，开发电化学免疫传感器,对玉米样品中的ZEN进行检测，检测范围为1×10-4～1×10-1ng/mL，检测限(0.15 pg/mL)和灵敏度(2 pg/mL)方面表现出非常好的分析性能。LIU等[23]采用多壁碳纳米管和金-铂纳米粒子修饰的玻璃碳电极上，并且利用葡萄球菌蛋白A将抗体定向固定在电极上，研发了安培型电化学传感器，该方法显示从0.005～50 ng/mL的线性范围，检测限为1.5 pg/mL，为实际食品样品中ZEN的监测提供了一种可行，可靠的方法。SADRABADI等[24]首次利用聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的多壁碳纳米管将石墨电极改性，同时引入DNA，利用ZEN与DNA在电极表面的相互作用通过腺嘌呤信号的变化来检测牛奶和小麦样品中的ZEN，该传感器方法检测限可以低至0.005 ng/mL。

酶催化放大技术也是电化学信号放大技术中运用较成熟的技术之一，通过催化底物发生氧化还原反应产生的电子传递来增强电化学信号，能够显著提高电化学生物传感器的灵敏度。常用的酶有葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。XU等[25]利用碱性磷酸酶放大技术，建立了电化学间接竞争免疫传感器，该传感器的设计与检测原理如图1所示。首先，由羧基官能化的cMWCNTs/Chit修饰玻碳电极以扩增免疫传感器信号并降低检测限，将ZEN-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)与活化的cMWCNTs/Chit膜共价偶联，在过量的ZEN抗体固定化过程中，ZEN-BSA与游离ZEN之间发生间接竞争。与抗体-碱性磷酸酶一起孵育后，当将α-磷酸萘酯底物加入作为氧化还原介体的二乙醇胺缓冲液中时，用差示脉冲伏安法进行测量。用该传感器对谷物和饲料样品中ZEN进行测定，具有较高的灵敏度，线性范围为10～1 000 ng/mL，检测限为4.7 pg/mL。

EDC+NHS-交联剂；α-NP；α-磷酸萘酯；cMWCNTs/Chit-多壁碳纳米管和壳聚糖组成的纳米复合材料图1 电化学免疫传感器的传感示意图Fig.1 Sensing diagram of electrochemical immunosensor

将光电化学分析技术(photoelectrochemical, PEC) 和和电化学发光技术(electrochemiluminescence, ECL)应用到电化学生物传感器中进行信号放大，提高检测灵敏度也是目前研究热点之一。PEC是指将光化学与电化学合并，利用光作为激发光源和光电流作为检测信号的检测方式[26]。在PEC检测中，利用光来激发光敏物质，并且电信号被转换为检测读数，使用两种不同形式的信号进行激发和检测，由于与其相关的背景减少，该技术具有潜在的高灵敏度。LIU等[27]采用光电化学分析技术，利用有序介孔氧化钴的氧化还原催化特性及多巴胺修饰二氧化钛微晶体形成自增强光电阴极矩阵，从而研发了灵敏的光电化学免疫传感器，对粮食及饲料中的ZEN进行测定。该传感器的线性范围为1×10-6～20 ng/mL，并且特异性，精密度和重复性好。ECL技术因其灵敏度高，仪器简单，ECL反应可控性强，成本低等特点，在分析检测中具有很好的发展前景[28]。ZHANG等[29]采用电化学发光技术，在四方金红石型TiO2介晶的双重作用下，建立了一种新型三明治型电致化学发光免疫传感器，实现了ZEN的灵敏检测，用于牛奶样品中ZEN的检测，回收率在94.2%～100.1%，重要的是，该方法可能为其他毒素检测开辟了一条新途径。

1.2 表面增强拉曼散射传感器(surface-enhaced raman scattering, SERS)

SERS是以生物成分为敏感元件或探测对象，研究生物分子间相互作用的重要工具之一，可以提供一个非破坏性和超灵敏的检测甚至低至一个单一的分子水平。LIU等[30]利用竞争性免疫反应，研发了表面增强拉曼散射传感器，并且成功应用于ZEN污染的多种天然饲料样品的分析，检测范围为1～1 000 pg/mL，检测限为1 pg/mL，具有很大的实际样品检测潜力。该传感器的设计与检测原理如图2所示。

图2 表面增强拉曼散射传感器的检测原理示意图Fig.2 Schematic diagram of detection principle of surface-enhanced Raman scattering sensor

第一步(图2-A)，制备SERS纳米探针。第二步(图2-B)，进行竞争性SERS免疫测定。相同体积的ZEN标准溶液和SERS纳米针同时滴在捕获基质的凹面上，此时固定在捕获底物上的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白与悬浮在SERS纳米探针上的ZEN抗体竞争偶联标准溶液中的ZEN抗原。如果纳米探针在捕获底物上结合，则显微拉曼光谱仪可从底物获得4,4’-联吡啶拉曼信号，检测样品中的ZEN。

1.3 表面等离子体共振生物传感器(surface plasmon resonance, SPR)

SPR促进了在换能器表面上发生的表面受限分子相互作用的检测，具有连续实时响应，无标记使用，高特异性和灵敏度等许多优点。EDUPUGANTI等[31]通过噬菌体分离重组玉米赤霉烯酮的单链抗体，研发了表面等离子体共振生物传感器，对高粱中的ZEN进行检测，检测限和定量限分别为(7.8±0.07) ng/mL和(13±0.03) ng/mL。HOSSAIN等[32]研发了多重表面等离子体共振生物传感器，并用于检测大麦中的呕吐毒素，ZEN，T-2毒素，赭曲霉毒素A，烟曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1，回收率和检测限均较为理想。

JOSHI等[33]通过金纳米颗粒放大SPR的信号，利用竞争性免疫反应，建立成像表面等离子体共振生物传感器。该传感器对小麦样品中的ZEN进行检测，检测限为24 μg/kg，平均回收率为87%～103%，与常见的真菌毒素及类似物未见交叉反应。此外，该传感器方便、快捷，只需要17.5 min。

1.4 荧光生物传感器

荧光生物传感器是以光学信号作为最终检测信号的一类传感器，当目标分析物加入后，可引起传感器中的荧光纳米感知识别元件(敏感元件)或荧光纳米传导元件(换能量)的荧光性质或参数发生改变，根据发生的

改变与目标分析物的结构或浓度所反映出的定量关系来检测目的分析物。WANG等[34]结合荧光偏振免疫分析，建立了荧光生物传感器，对玉米种霉菌毒素进行检测，检测限及回收率均较为理想。ZHANG等[35]研发了基于新型单克隆抗体的荧光生物传感器，用于玉米中ZEN的检测。该传感器检测限为12 μg/kg，回收率范围为84.6%～113.8%，加标样品的变异系数在15.3%以下。LIU等[36]利用生物素-链酶抗生物素系统提高灵敏度，建立了荧光生物传感器，对玉米粉和以玉米基础的婴儿食品中的ZEN及其衍生物进行检测，ZEN的半数抑制浓度为0.18 ng/mL，α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol, α-ZOL) 为0.39 ng/mL，β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol, β-ZOL)为0.46 ng/mL，玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN) 0.30 ng/mL，α-玉米赤霉醇(α-zearalanol, α-ZAL) 0.30 ng/mL，β-玉米赤霉醇(β-zearalanol, β-ZAL) 0.73 ng/mL。将该传感器应用于筛选天然污染的玉米样品，检测结果与高效液相色谱-串联质谱联用技术结果相关性良好。

ZHAO等[37]采用生物素-亲和素系统，利用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶标记ZEN-牛血清白蛋白偶联物作为竞争者，结合磁纳米颗粒的磁分离效应，建立了纳米荧光生物传感器，并用于玉米样品中ZEN的检测，检测限低至0.13 ng/mL。为了进一步提高荧光传感器的灵敏度，HENDRICKISON等[38]利用高灵敏度的化学发光底物替代过氧化物酶标记的传统比色底物,检测限低至4 pg/mL，总检测时间为25min，对红葡萄酒和白葡萄酒中的ZEN进行检测，检测限分别为0.03和0.05 ng/g，该方法具有普遍性，是快速控制各种污染物的有效工具。ZHAN等[39]利用量子点无与伦比的光学特性，结合过氧化氢酶对H2O2的高催化活性和量子点对H2O2的敏感性，建立了量子点生物传感器检测玉米中的ZEN。该传感器在2.4～1.25 ng/mL线性良好，检出限为4.1 pg/mL。ZHANG等[40]结合生物素-链霉抗生物素蛋白系统的特异性结合能力和磁性纳米粒子的分离特性，建立了纳米荧光生物传感器，用于谷物和饲料样品中ZEN的检测。该传感器线性范围为0.07～2.41 ng/mL，检测限为0.04 ng/mL，适用于在相关实验室中快速检测谷类和饲料样品中的ZEN。

2 分子识别型生物传感器

2.1 核酸适配体生物传感器

核酸适配体生物传感器是以ZEN适配体分子识别物质，以与ZEN的特异性作用引起的直接或间接信号变化对小麦、玉米、饲料等样品中ZEN进行检测的传感器。

WANG等[41]成功筛选出ZEN的单链DNA,建立核酸适配体生物传感器，对玉米样品中的ZEN进行检测，检出限和半抑制浓度分别为0.01和0.2 ng/mL。WU等[42]利用上转换纳米粒子的低自发荧光背景、良好的光化学稳定性，磁性纳米颗粒的磁分离效应及核酸适配体的高特异性，研发了基于纳米粒子的适配体传感器，对玉米及啤酒中的ZEN进行检测，具有良好的回收率和检测限。NIAZ等[43]提出了基于ZEN适配体标记的胺官能化磁性纳米粒子作为捕获探针和时间分辨荧光纳米粒子标记互补DNA作为信号探针，建立核酸适配体生物传感器，用于检测农产品和食品中的ZEN，线性范围为0.001～10 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL。TAGHDISI等[44]结合金纳米颗粒与核酸外切酶III的信号放大功能，建立了比色核酸适配体传感器，能够在宽线性动态范围(20～80 000 ng/L)内检测到ZEN，检测限为10 ng/L。

GOUD等[45]将氧化石墨烯(FGO)作为羧基荧光素(FAM)的荧光猝灭剂，修饰有FAM的ZEN适配体(FAM-aptamer)与FGO形成基态复合物导致荧光猝灭，而目标分析物ZEN出现后，由于目标物ZEN与适配体特异性结合，荧光强度恢复值与ZEN浓度呈正比，据此原理(图3)建立了适配体传感器用于啤酒及葡萄酒样品中ZEN的检测，检测范围为0.5～64 ng/mL，检测限为0.5 ng/mL。

FAM-Aaptamer-羧基荧光素标记的适配体；FGO-羧基官能化的氧化石墨烯图3 核酸适配体传感器示意图Fig.3 Schematic diagram of aptamer sensor

2.2 细胞传感器

细胞传感器是由固定或未固定的活细胞与电极或其他转换器组合而成的一类生物传感器。当活细胞与分子识别元件特异性结合后，产生的信息通过换能器转换为可定量和可处理的信号，从而达到分析检测的目的。细胞传感器已成为生物传感器研究领域的一大热点。JI等[46]首次研发了人胚肾293细胞(HEK-293)荧光传感器并用于检测和评估由镰刀菌产生的常见食物污染物ZEN，回收率和检测限均较为理想，检测限为3.2 ng/mL。细胞传感器也常用于评价ZEN等其他真菌毒素的毒性，DU等[47]研发了一种基于细胞的电化学生物传感器来评估DON和ZEN对BEL-7402细胞的个体和组合毒性。SUN等[48]为了更加灵敏的评估ZEN的毒性，在DU等[47]的基础上，开发了基于细胞的电化学生物传感器来评估DON，ZEN和AFB11在Hep G2细胞上的个体和组合毒性，与传统的细胞毒性评价方法相比，该方法简单，方便，灵敏，反应速度快。

3 讨论与展望

生物传感器检测技术由于快速、灵敏、简单经济的优点，在ZEN污染检测控制方面发挥重要的作用，但是根据目前的研究发现多方面需要进一步研究。

(1)信号放大技术中纳米放大技术是发展较快的放大技术，依托新材料领域的高速发展，可以探索更多的纳米材料应用于食品检测领域如介孔二氧化硅纳米材料，上转换纳米粒子等。

(2)酶放大技术中目前发现具有易变性、不稳定、易被破坏等特点，只应用酶放大技术存在一定局限性，而核酸适配体具有特异性强、在非生理条件下的高稳定性、低成本、易修饰等特点成为近年来研究的热点。在酶作为放大识别过程的催化探针时，与易修饰的核酸适配体相结合，将有效提高检测方法的灵敏度与稳定性。

(3)ZEN的代谢产物α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL及ZAN通过强烈的雌激素活性而产生有害的健康效应，很多还属于隐蔽型毒素，其结构、极性、溶解度和分子质量较母体分子发生变化，通过传统的前处理和检测方法常常漏检，多通道的、可同时检测ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL及ZAN等衍生物的生物传感器检测技术是未来还需进一步研究的方向。

(4)目前，用于检测食品原料及饲料中ZEN的传统方法主要是以色谱为主的精准检测技术(高效液相色谱法、气象色谱法等)和基于免疫技术的快检方法(ELISA、胶体金快速测试卡法等)。传统的依托大型精密仪器的精准检测技术可以准确定量目标物的含量，但需设备昂贵，样品前处理时间长及繁琐，费用高，需要专业的操作人员，不易推广，不适用于现场快速检测样品。而目前的快速检测方法能够达到现场快速检测样品的要求，但是灵敏度和准确度低，假阳性率高，不能达到准确分析检测的目的。因此，仍然需要灵敏度及准确性高，简便快捷，经济，能够达到实时分析和经济要求的检测方法。生物传感器技术作为ZEN检测的前景替代方法，具有高专一性、高选择性、便携性和实时分析的性能，具有可观的发展前景。