不同干燥方法对菌体蛋白氨基酸分离鉴定的影响

郭凤柱，谭之磊，时艺翡，宋富，钟其顶，贾士儒*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457)2(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)3(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)

ε-聚-L-赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是目前从自然界中已发现的两种氨基酸同聚物之一，它是由微生物代谢合成的(主要为放线菌[1]，另外个别细菌也可以合成[2])含有25～35个L-氨基酸残基的同聚氨基酸，这些L-赖氨酸(L-Lys)残基通过α-羧基和ε-氨基连接[3-4]。因其具有安全性高[5]、抑菌谱广[6-8]、水溶性好和热稳定性强[9-10]等特性，ε-PL已广泛应用于食品、医学和生物材料等领域[11-17]。我国于2014年4月批准了ε-聚赖氨酸及其盐酸盐作为食品添加剂新品种[18]。为了适应ε-PL在食品应用方面需求量的增大，许多研究者已投入到旨在提高ε-PL产量的研究中。但由于ε-PL的生物合成及整体调控机制尚不十分明确[19]，因此，对其生物合成过程中的代谢网络进行定量分析是十分必要的。

13C同位素示踪技术作为代谢流分析的方法之一，因其可以准确、快速、直观的反应代谢流向和流量，受到越来越多科研人员的青睐。13C同位素示踪研究中，由于中间代谢物反应速度快、浓度低、难以及时定量分析，而菌体蛋白氨基酸作为菌体的重要组成成分，并与产物前体之间有着很好的对应关系。因此，可以根据菌体蛋白水解氨基酸的标记信息来推测胞内代谢物的标记信息，进而根据胞内标记代谢物的平衡和代谢网络的化学计量关系进行代谢通量分析[20]。所以，菌体蛋白水解氨基酸的分离提取是开展13C稳定同位素示踪研究的关键技术问题。钟其顶等采用氮吹法成功制备了酿酒酵母菌体蛋白氨基酸[21]；申铁[22]、ZAMBONI等[23]采用高温(100 ℃)干燥法对大肠杆菌菌体蛋白氨基酸进行了分离；但是关于链霉菌菌体蛋白氨基酸的分离制备目前鲜有报道。因此，通过采用不同预处理手段，对酸水解后的菌体氨基酸进行干燥，以探索不同干燥方法对淀粉酶产色链霉菌菌体蛋白氨基酸分离鉴定的影响，并建立高效的菌体蛋白氨基酸制备方法，为今后实施13C稳定同位素示踪技术在链霉菌中的应用，揭示ε-PL发酵过程的代谢机理提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种和培养基

淀粉酶产色链霉菌(StreptomycesdiastatochromogenesCGMCC3145)，由天津科技大学从海南岛土壤样品中分离筛选获得，现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。

斜面固体培养基(Bennett’s，g/L)：葡萄糖 10，牛肉膏 1，蛋白胨 2，酵母浸粉 1，琼脂 15～20，2 mol/L NaOH调pH 7.7，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

种子/发酵培养基(M3G，g/L)：葡萄糖 50，酵母浸粉 5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO41.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，氨水调pH 7.2，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.2 试剂

氨基酸标准品(Sigma-Aldrich公司，美国)；无水葡萄糖(Solarbio公司，中国)；N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA≥95%，Sigma-Aldrich公司，瑞士)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，色谱纯，Adamas公司，中国)；HCl(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)等。

1.2 仪器与设备

7890A-5795C气相色谱与质谱联用仪(GC-MS)，美国Agilent Technologies；HYG-Ⅱ迴转式恒温调速摇床，上海欣蕊自动化设备有限公司；LRH-100-S恒温恒湿培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；5804R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；FD-1真空冷冻干燥机，上海田枫实业有限公司；HN 200多功能氮吹仪，山东海能科学仪器有限公司；GZX-9070 MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂等。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

将保藏菌种接至Bennett’s固体斜面，30 ℃，湿度50%的条件下恒温恒湿培养5～7 d，直至长满孢子，置于4 ℃冰箱中保存待用。

从孢子斜面挑一环孢子接于含有100 mL M3G液体培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min条件下摇床培养30 h。

将种子液以6%接种量接于含有100 mL M3G液体培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min条件下摇床培养。隔一定时间取样，确定发酵液中的菌体生长。

1.3.2 样品处理方法

取对数中后期发酵液，4 ℃ 1 2000×g离心5 min，收集菌体；将菌体用无菌水洗2次，取约100 mg湿菌体于15 mL离心管中，加入4 mL的6 mol/L盐酸后在85 ℃下水解24 h[24]，水解液经0.22 μm滤膜过滤后获得淡黄色氨基酸液体，分别取50 μL氨基酸标准液、菌体水解液于1.5 mL新的EP管中，样品分别进行真空冷冻干燥、氮吹仪40 ℃吹干、烘箱95 ℃烘干。最终得到黄色氨基酸晶体。

1.3.3 氨基酸的衍生

加入100 μL DMF辅助衍生试剂，振荡混匀，然后加100 μL MTBSTFA衍生试剂，再次震荡混匀，80 ℃衍生反应60 min，反应完成后冷却至室温，离心取上清，待进入GC-MS检测[21,23]。

1.3.4 氨基酸的测定

色谱条件：HP-5色谱柱，载气为氦气，柱流速1.0 mL/min，进样口温度250 ℃，升温程序为：起始温度120 ℃，保持2 min，以3.0 ℃/min升温至250 ℃，再以10 ℃/min升温至270 ℃保留10 min；进样体积1 μL，分流比10∶1[21,23]。

1.3.5 生物量的测定

将化学分析滤纸编号，95 ℃烘干至恒重，称量，备用。吸取4 mL发酵液，6 000×g离心10 min，弃掉上清液。将菌体冲洗至滤纸上，并用适量去离子水洗涤2～3次，95 ℃烘干至恒重，称量，计算生物量(biomass, g/L)。

2 结果与分析

2.1 菌体蛋白氨基酸制备取样点的确定

根据方法1.2.1，菌株S.diastatochromogenesCGMCC3145种子培养30 h后，以6%接种量转接至M3G发酵培养基中培养，每隔4 h取样分析其生物量的变化，菌株CGMCC3145的生长曲线如图1所示。在菌体生长的指数中后期，其细胞内代谢系统达到稳定状态[11]，所以选取24 h作为菌体氨基酸制备的取样点。

图1 发酵培养基中菌株CGMCC3145的生长曲线Fig.1 Growth curve of strain S. diastatochromogenes CGMCC3145 cultivated in fermentation medium

2.2 氨基酸标品的测定

对氨基酸标准品采用不同干燥方法处理后，经衍生化，进行GC-MS分析，由图2总离子流图中峰的定性分析可知：(1)标准品中16种氨基酸均能被检测(仅烘干法中鸟氨酸未检出)；(2)出峰顺序依次为：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鸟氨酸(精氨酸)、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸；(3)各氨基酸的分离效果较好。

A-真空冷冻干燥法；B-氮吹法；C-烘干法图2 不同干燥处理方法下氨基酸标品的气相色谱图Fig.2 The GC chromatogram of amino acid standards with different drying treatment

2.3 菌体蛋白氨基酸的测定

同样，菌株S.diastatochromogenesCGMCC3145菌体蛋白氨基酸采用不同干燥方法处理后，再经衍生化，进行GC-MS分析，总离子流图结果如图3所示(各个菌体蛋白氨基酸保留时间与氨基酸标准品保留时间基本一致)。由于菌体蛋白盐酸水解过程中，天冬酰胺转化为天冬氨酸，谷氨酰胺转化为谷氨酸，色氨酸、半胱氨酸被破坏。因此，最多可检测出16种氨基酸。通过对总离子流图中峰的定性分析发现，经真空冷冻干燥处理后(图3-A)，检测到16种氨基酸；采用氮吹法处理后(图3-B)，检测到14种氨基酸，相较于真空冷冻干燥法，并未有鸟氨酸、组氨酸检出；采用烘干法处理后(图3-C)，共有15种氨基酸检出，相较于真空冷冻干燥法，鸟氨酸未检出。这可能是由于鸟氨酸在样品中本身含量极低(由表1可知)，且经氮吹法或烘干法处理后，受氨基酸热降解影响进而无法被检出。

A-真空冷冻干燥法；B-氮吹法；C-烘干法图3 不同干燥处理方法下菌体蛋白氨基酸的气相色谱图Fig.3 The GC chromatogram of protein-bound amino acids with different drying treatment

表1 不同预处理方式对获得菌体蛋白氨基酸种类及含量的影响Table 1 The effect of different pretreatment on protein-bound amino acids

注：“-”表示未检出。

进一步对不同处理方式下菌体蛋白氨基酸的GC-MS谱图进行分析，发现对于同一氨基酸而言，不同的预处理方法对其含量有显著影响，以L-Alanine为例：使用真空冷冻干燥法检测的L-Alanine含量分别是使用烘干法和氮吹法检测含量的1.46倍和1.86倍；而对于相对含量较少且对温度敏感的组氨酸[25]而言，使用真空冷冻干燥法检测的含量是使用烘干法检测含量的11.65倍，氮吹法处理组则未检出组氨酸，这可能是由于氮吹法干燥过程较为迅速且通过氮气对受热样品进行吹扫增大了样品受热面积从而加剧了组氨酸热降解。而在代谢通量分析中，胞内代谢物的标记信息是根据菌体蛋白氨基酸的标记信息推测的[20,23,26]，因此，选取真空冷冻干燥法作为淀粉酶产色链霉菌菌体蛋白氨基酸制备的方法。

3 结论

对菌体蛋白水解氨基酸分别用不同的处理方法进行干燥处理，无论从氨基酸检出的种类还是从氨基酸检出的峰面积(含量)角度考虑，真空冷冻干燥的方法均优于其余2种方法。本文建立了淀粉酶产色链霉菌中菌体蛋白氨基酸的制备方法，为今后开展13C同位素代谢通量分析、深入了解淀粉酶产色链霉菌中心碳代谢途径中的通量分布，对生产菌株合理的代谢改造提供了技术保障。