硒多糖的合成方法及其特性研究进展

齐鹏翔，黄双霞，陈华磊，王帅静，蓝尉冰，陈玉颖，陈 山，3，*

(1.糖业及综合利用教育部工程研究中心，广西南宁530004;2.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004;3.广西蔗糖产业协同创新中心，广西南宁530004)

硒是维持人体和动物正常生理功能所必需的微量元素，在提高机体免疫力、保护神经系统、抗氧化、抗肿瘤等方面都发挥着重要的作用［1］。无机硒主要存在土壤、水、大气等自然环境中，一般指单体硒以及亚硒酸、亚硒酸盐等无机化合物。因其在体内停留时间相对较短，多余的硒会随着尿液很快排泄出体外，生物相容性较低，毒副作用较强［2－3］。有机硒主要存在于动植物体内，主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白质等有机化合物［4］。人体缺硒会引起高血压、免疫缺陷、甲状腺肿大等多种疾病［5］。硒多糖作为一种理想的补硒剂，可以根据人体的缺硒情况来进行动态的储存和缓释，以满足机体补硒的目的［6］。

硒多糖的单糖组成一般分为单一聚糖和杂聚糖两类，杂聚糖中的单糖通常为D－构型。硒多糖的主链主要以1→3糖苷键连接，大多数为β－构型，也有发现少数的α－构型。硒多糖既保持了多糖较高的生物利用率和参与机体生理代谢的特点，又具有硒的生物功能，且毒性和副作用大大降低，生物活性普遍高于硒和多糖［7］。天然硒多糖主要来源于植物和具有富硒能力的微生物，由于植物和微生物的硒富集作用是有限的，从而导致天然硒多糖含量较少。因此，硒多糖的合成优化与开发仍是寻找先导有机硒和候选药物的热点研究方向。本文就硒多糖的结构及合成方法进行阐述，并对其安全特性的研究进行分析和讨论。

1 硒多糖的合成方法

目前，人工合成硒多糖的方法主要包括化学合成法、植物转化法和微生物转化法。

1.1 化学合成法

硒多糖的化学合成法主要是利用多糖链上的羟基、氨基等活性基团与硒化试剂中的含硒化合物结合，从而将无机硒通过共价键接合在糖链上，形成硒多糖。

1.1.1 以单体硒或含有亚硒酸根离子(SeO23－)的化合物为硒化体系合成硒多糖 在H2SeO3/HNO3和BaCl2的硒化体系中，HNO3和BaCl2作为催化剂可以加快硒化反应的进行。HNO3可以为反应体系创造酸性环境，使多糖链上活性基团和硒化试剂发生反应。由于BaCl2中的Ba2+与羟基的强配位作用［8］，有利于促进配合物的形成。较强的配位性可以增强羟基的亲核性并形成稳定单一的配合物，如图1所示。

图1 酸性条件下BaCl2催化硒多糖合成的反应机理［9］Fig.1 Synthesis mechanism of selenium polysaccharide catalyzed by BaCl2 under acidic conditions［9］

Wang等［9］先从沙蒿中萃取出沙蒿多糖(ASP)，使用H2SeO3为硒化试剂，以HNO3和BaCl2作为催化剂催化合成了沙蒿硒多糖(SeASP)。随着BaCl2的加入，硒多糖的含硒量有显著的增加，说明Ba2+可以提高硒化反应体系的硒化效率。Wei等［10］针对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)合成了具有预防和治疗效果的海参硒多糖衍生物(Se－RHP)。Zhang等［11］使用 HNO3为催化剂，Na2SeO3为硒化试剂，以硒含量为指标，通过正交试验优化红枣硒多糖的合成工艺。该法硒化成本较低，但反应步骤较多，产率低，较难实现产业化生产。

通过优化硒化反应体系的物理条件，可以促进反应的进行，提高合成效率，减少化学试剂的使用量。胡向东等［12］向溶解有多糖的稀HNO3溶液中，充入惰性气体，将硒化试剂(Na2SeO3)以喷雾形式添加入反应体系。该方法增加了反应体系的接触表面积，同时避免了硒化试剂的氧化，提高了反应的效率。微波、超声波辅助合成因其方法简单，具有较高的效率，逐渐成为研究热点。Zhu等［13］采用超声波辅助合成了蛹虫草硒多糖(SeCPS)。Zhao等［14］将蕨麻多糖(PAP)与稀HNO3混合，加入Na2SeO3后，在一定的温度下进行微波辅助硒化反应的进行，得到的蕨麻硒多糖(SePAP)仍然具有良好的生物活性。采用物理辅助合成硒多糖的产率高，减少化学重金属催化剂的使用，操作步骤简单，反应易控制，生产工艺绿色环保，适用于工业化生产。

1.1.2 以二氯氧化硒(SeOCl2)为硒化体系合成硒多糖 光气(COCl2)可以与糖链上相邻的两个羟基(－OH)反应，生成顺式的五元环形结构的碳酸酯(1，2)。而与COCl2的结构、性质相似且同样具有酰氯结构的二氯氧化硒(SeOCl2)可以与醇作用生成亚硒酸酯型的化合物。龚晓钟［15］将黄芪多糖Ⅱ(D－葡聚糖)加入到无水吡啶中，搅拌均匀后加入硒化试剂(SeOCl2)，得到浅粉色的黄芪硒多糖Ⅱ。姜礼辉等［16］在此基础上改进了酰氯硒化法。该法先将黄芪多糖加入到无水吡啶介质中，充分分散均匀后依次滴加 SeOCl2、C4H6O4(丁二酸)、NaNO3溶液，得到硒化黄芪多糖。NaNO3作为稳定剂，提高了产物的稳定性。加入C4H6O4(丁二酸)可以加快反应的进行，减少硒化试剂的用量和硒化反应时间，提高了硒化效率和生物学效价。但SeOCl2不易制备且性质不稳定，在空气中容易发生水解，此反应还会产生H2Se等有毒气体，制备过程繁琐，产率较低。对于SeOCl2硒化法的改进和优化，仍是今后的研究方向。

1.1.3 以含硒有机基团为硒化体系合成硒多糖 支链中存在着氨基、羟基等活性基团的多糖，可以通过添加不同种类的有机含硒化合物对支链结构进行修饰，从而得到硒多糖。张帆［17］利用含有氨基和羟基的天然高分子壳聚糖，分别加入邻甲硒基苯甲酸－(对－硝基)苯酚酯、2－(4－苯甲酸甲酯)－1，2－苯并异硒唑－3(2H)－酮、硒代二乙酸，采用化学合成的方法对壳聚糖进行硒化，分别得到了三种硒壳聚糖衍生物。合成的硒化壳聚糖脱乙酰度明显降低，可能是由于壳聚糖中的氨基和羟基与硒化试剂发生化学反应，引入了亲水基团，其水溶性和抗氧化活性都有很大的改善，有利于提高硒化壳聚糖产品的稳定性和生物利用率［18－19］。

1.2 植物转化法

通过植物的生物富集作用来转化有机硒，是目前最有效、最安全的选择之一。人体硒来源主要通过动植物硒的摄入，而动物的硒来源主要通过植物来获取，故植物硒相比动物硒具有更高的生物效价［20］。硒多糖的植物转化法就是利用植物的根和叶对无机硒(主要是Se4+和Se6+)的吸收，通过自身的生长代谢和生物转化作用，将添加到土壤或培养基中的亚硒酸盐、硒酸盐等与多糖结合转化成为硒多糖。土壤酸碱类型的不同硒的存在形式在亚硒酸钠和亚硒酸之间转化，影响着植物中硒的积累速度［21］。不同植物的含糖量不同，对硒的富集作用差别也比较大［22］。所以一般含硒多糖较多的植物，其本身也有一定的含糖量。一般选用党参、黄芪、小麦、油菜等富硒较多的植物来进行植物转化硒多糖的原料。

通过植物进行富硒培养，一般以盆栽实验和叶面喷洒法为主。Zhu等［23］采用盆栽实验，向土壤中分别施用不同浓度的Na2SeO3，对党参进行富硒培养。与对照组相比，富硒培养党参的根、茎、叶片、果实中均能检测到更多的总黄酮、多糖、总皂苷含量。党参从根部吸收无机硒后，硒原子主要与可溶性蛋白相结合，同时也有部分无机硒与多糖结合生成党参硒多糖［24］。Galinha 等［25］同样采用盆栽实验研究了通过土壤添加硒肥小麦富硒的能力。结果表明，在施用最佳浓度硒肥时，与未施硒肥作物相比，Jordo、Roxo、Marialva 和 Celta 四种小麦中的硒含量可分别提高2、16、18 和20 倍。Fahim 等［26］采用叶面喷洒法，研究了在叶面喷洒硒溶液可降低细胞的渗透压，提高了叶片的蒸腾速率，还可能参与植物体内糖类的合成过程，从而增加植物体内硒多糖的积累。由于土壤吸附、化学和微生物的作用，可能会引起硒的损失或者转化［27］。所以，与盆栽法相比，叶面喷洒硒的方法有简单、高效、成本较低等特点。目前，洋葱［27］、胡萝卜［28］、大蒜［29］、稻米［30］、小麦［31］等通过叶面喷洒硒溶液已经获得良好的富硒效果。

无论采用盆栽实验还是叶面喷洒法，都是通过外源性添加无机硒，利用植物的吸收代谢作用，将无机硒转化为有机硒。再以收集富硒后的植物为原材料，经过洗涤、干燥、粉碎等前处理后，采用热水浸提［32］、稀碱液浸提［33］、微波－超声波辅助提取［34］等方法来提取出植物硒多糖。所以，植物转化法中提取硒多糖的前处理较为复杂，又由于植物的生长周期较长，在一定程度上限制了植物转化法的高效生产。

1.3 微生物转化法

硒元素与硫元素在化学周期表中同主族，两者有着相似的化学性质，硒在微生物体内的转运机制与硫较为相似。被微生物吸收的硒经过生物体内氧化、还原等过程，可在细胞中形成具有可溶性(和)和不溶性(Se0)形式的硒作为末端电子受体来参与硒化合物的转运［35］。微生物对硒的积累一种是在细胞外，硒与细胞壁中多糖类物质的生物吸附组装结合形成配体;另一种是在细胞内，硒离子通过细胞膜的特异性转运进入细胞质，进行生物富硒作用［36］。

1.3.1 无机硒微生物转化法 无机硒微生物转化硒多糖就是在温和的培养条件下，将真菌、细菌等微生物的培养基中添加适宜浓度的外源性无机硒，将环境中添加的无机硒结合到细胞多糖的结构上。近年来，关于在营养培养基中加入无机硒如亚硒酸钠(Na2SeO3)，在一定的条件下，培养酵母、灵芝、蘑菇等真菌的报道越来越多［37－39］。酵母培养简单、易生长，是世界公认的安全可食用性微生物之一，被广泛应用于食品工业、制药工程、基因工程等领域。酵母细胞具有很强的富硒能力和生长能力，可以通过自身的代谢，将吸收转运的无机硒与细胞生物质结合，从而生成有机硒［37］。蘑菇能够从土壤或营养培养基中积累许多微量元素，包括硒，使得这些微生物成为日常饮食中硒的重要来源［38］。根据研究表明，酵母菌和真菌细胞壁成分(如多糖和蛋白质)可通过生物吸附作用与无机硒化合物结合［39］。采用细菌合成硒多糖也是一种稳定高效的合成方法。Zhou等［40］选择阴沟肠杆菌Z0206，在富硒(Na2SeO3)培养基中得到活性稳定的硒多糖(Se－ECZ－EPS－1)，实现了将无机硒向硒多糖的有效转化。由于无机硒化合物对菌体具有一定的毒副作用，高浓度的无机硒会影响菌体的正常生长，从而在一定程度上限制了生物体内有机硒的高生物量积累。

1.3.2 有机硒微生物转化法 为了避免无机硒对菌体的毒副作用，Malinowska等［41］首次将有机形式的硒(Selol)加入营养培养基中培养猴头菇(Hericiumerinaceus)，与无机硒(Na2SeO3)加入营养培养基的对照组相比，添加有机硒的猴头菇合成了更多的硒多糖，并且具有更好的抗氧化能力。通过添加Selol来进行微生物富硒培养，减少了无机硒对菌体细胞毒副作用的影响，对未来膳食补充剂中的新型硒源探索有着良好的指导作用。

微生物转化法中生物机体的生长周期较植物转化法短，产物活性较为稳定，不易分解。但培养菌体所需成本较高，硒化体系较为复杂，从而导致产物分离较为困难。

2 硒多糖的生理特性

2.1 硒多糖的免疫活性

近年来，对硒多糖的免疫活性研究已成为国内外研究的热门课题。Chen等［42］发现银杏硒多糖(Se－GBLP)可增强促凋亡Bax蛋白的表达，使线粒体膜电位丧失，从而导致人体膀胱癌T24细胞的凋亡，可作为预防或治疗膀胱癌的潜在药物。淋巴细胞的增殖情况反映了细胞免疫状态［43］，并且是评估细胞免疫功能的重要指标［44］。路则庆［42］研究了由细菌(Enterobacter cloacae Z0206)生物转化后的硒多糖(Se－ECZ－EPS)对断奶仔猪的免疫改善作用。结果显示，在日粮中添加 Se－ECZ－EPS比添加 Na2SeO3的仔猪体重有明显的提高，硒多糖组明显提高了仔猪的血清中免疫球蛋白、细胞因子的含量，促进了抗菌肽基因PR－39的表达，说明硒经过生物多糖修饰后，可显著增强仔猪的免疫能力。Qin等［45］从天然当归中提取当归多糖(CAP)进行不同程度的硒化修饰，以未经硒化的当归多糖进行对照，对比两组鸡淋巴细胞的增殖情况。结果表明，硒化修饰后的当归多糖可以显著提高淋巴细胞的增值能力，从而具有更好的细胞免疫活性。

2.2 硒多糖的毒性

多糖类物质对药物进行修饰能够降低先导化合物的毒性并提高其药用活性，在糖修饰之前一般具有很强的毒副作用，经过多糖修饰后，毒性明显降低，并且活性得到了提高［13，19，42，46］。虽然硒多糖要比无机硒的毒性低，但其仍具有潜在的毒性［47］。Lin等［48］使用桔梗硒多糖对小鼠进行急毒研究:分别注射相同浓度梯度的Na2SeO3和硒多糖，观察小鼠身体机能变化。数天后，硒多糖高剂量组出现情绪低迷、腹泻等中毒症状;而亚硒酸钠高剂量组出现呼吸困难、抽搐，甚至死亡等更加严重的中毒现象。观察小鼠的健康状态，初步推断出亚硒酸钠相比硒多糖在相同浓度的情况下具有更强的毒性。与无机硒相比，有关硒多糖的安全性报道相对较少，还有待进一步建立成熟的硒多糖评价体系。目前，已成功合成的甘草硒多糖、硒化黄芪多糖、硒化壳聚糖等，被广泛应用于癌症、氧化损伤、高血脂等疾病的辅助治疗［15，18］。为了评估硒多糖临床应用的可靠性，需要先对不同浓度的硒多糖进行安全性评价。经过毒性实验筛选出硒多糖的安全浓度范围，这对之后实际应用和生产都具有重要的指导作用。

3 结语

随着硒多糖的生理活性越来越受到人们的重视，其合成方法逐渐成为了研究热点。目前，硒多糖的合成主要通过化学转化和生物代谢两种方式对多糖进行硒化改性。虽然各方法都有其限制条件，但通过生物代谢合成硒多糖可减少化学试剂的使用，避免了重金属催化剂的添加，得到的硒化产物毒副作用较低，较符合临床的使用条件。所以，人工合成硒多糖应用较为广泛的是植物和微生物转化法。但硒多糖的合成方法还有待进一步的深入研究，新型合成方法应具有更加简单的合成体系、高效的硒化效率、产物活性更加稳定等特点。

虽然多糖经过经硒化修饰后可以增强其免疫活性，但由于目前硒多糖合成方法的研究并不十分完善，其生成产物的潜在毒性依然要引起重视。所以，如何构建科学的硒多糖毒性评价体系是将来的研究重点。这对提高富硒药物的疗效，生产、研发更加安全健康的食品以及保健品领域都具有十分重要的意义。