间充质干细胞应用于卵巢储备功能减退治疗的研究进展

曹孟，蒋春艳，崔毓桂，覃莲菊

(南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京 210029)

卵巢内卵母细胞的数量(即卵巢储备)反映卵巢生殖功能状态。卵巢储备功能减退(Diminished ovarian reserve，DOR)是指女性卵巢内剩余的卵母细胞数量较少或质量较低而导致生殖能力衰减的一种病理症状，在女性不孕因素中约占10%。DOR患者仍维持正常的月经周期，但卵巢对促排卵药物反应低，助孕结局相对差。目前DOR的发病机制尚不明确，病因复杂，主要有年龄因素、遗传因素(如脆性x综合征)、自身免疫性疾病(如肾上腺损伤)、医源性因素(放疗、化疗或手术)等。目前DOR临床治疗方法包括人工辅助生殖技术(ART)、激素替代疗法(HRT)、卵巢移植、线粒体移植等。但是，因DOR患者卵巢反应低，ART成功率并不高；HRT仅能改善患者部分临床症状，并不能从根本上改善DOR患者的卵巢功能和生殖能力，且有增加患者血栓性疾病、卵巢肿瘤及乳腺癌的风险；赠卵尚存在医学伦理问题；而卵巢移植、线粒体移植尚需突破技术瓶颈。因此，临床迫切需要探讨有效的DOR治疗新方案以提高DOR患者的生殖能力，提高其ART助孕的活产率。

干细胞具有多向分化潜能，在诱导条件下能分化为特定类型的各类组织细胞[1]，在再生医学领域具有重要应用前景。其中，间充质干细胞(MSCs)来源充足、免疫原性低，同时可避免伦理问题，国内外已应用于多项组织修复/再生医学的临床研究[2]。近年研究显示，不同来源的MSCs均可改善小鼠受损的或者自然衰老的卵巢功能及卵巢储备[3-4]，提示MSCs治疗有望成为提高DOR患者生殖能力的新型疗法。本文综述MSCs特性及其治疗DOR的基础与临床研究进展。

一、MSCs特征

1968年Friedenstein等首先发现并分离了成人骨髓MSCs(BMMSCs)，之后研究者陆续从许多成体组织中分离到相应的MSCs[5]，表明MSCs易于分离、体外增殖，免疫原性低，且具有遗传稳定性[6]。2006年，国际细胞治疗协会的间充质干细胞和组织干细胞委员会明确了人类MSCs的基本识别特征[7]：(1)在标准培养条件下，MSCs可在塑料培养板上贴壁生长；(2)体外高水平表达CD105、CD73和CD90，不表达或极低水平表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19及HLA-DR；(3)具有体外分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞的能力。

MSCs具有免疫调节及抗炎、抗凋亡、促伤口愈合及组织修复等功能[8]。MSCs移植到体内后，能迁移到受损组织(也称归巢)并分化成组织特异性细胞从而达到修复的目的[9]，或驱动由内源性细胞触发的修复[10-11]。早在2008年，Yoshikawa等[12]的一项临床研究，利用含自体BMSCs的移植物治疗了18例患者不同原因的不愈合创面，所有受试者的皮肤创面均获得了完全的再上皮化。Xu等[13]报道一项小样本的瘢痕子宫MSCs治疗的临床研究，将附着人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的可降解智能生物材料置入患者的瘢痕子宫，发现hUCMSCs促进了瘢痕处内膜、肌层及血管的再生；同时发现，经 hUCMSCs治疗后子宫瘢痕得到功能性恢复，甚至可正常妊娠。目前，许多研究关注于MSCs在细胞疗法中的应用。MSCs被用作治疗关节退行性变化和重建骨骼和软骨的工具，用于整形手术、美容医学、心血管疾病、内分泌和神经系统疾病，以及修复受损的肌肉骨骼组织[14]。最近，脂肪来源的干细胞产品已被欧洲药品管理局注册用于治疗复杂的肛周瘘[15]。之前一个加拿大的研究小组分析了使用人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的临床试验，在对36项研究进行彻底分析后，他们发现MSCs的使用与致瘤潜力之间没有关系，印证了临床应用的安全性[16]。越来越多的临床研究均表明MSCs在明显改善治疗结局的同时并没有报道严重的毒副作用[17-19]。

二、 MSCs在DOR动物模型的应用研究

近年较多实验研究，探讨MSCs修复卵巢储备功能。Asif等[20]采用连续15 d(50 mg/kg/d)腹腔注射CTX的方法化疗构建卵巢功能早衰(Premature ovarian failure，POF)的小鼠模型，将1×106个hUCMSCs通过静脉注射移植至POF小鼠体内，一周后卵巢获卵数(108±15)个，而对照组POF模型小鼠的获卵数为(39±13)个(P<0.01)，hUCMSCs治疗组血清E2水平也明显高于对照组(P<0.05)；卵丘细胞凋亡减少，卵巢储备功能明显改善。Mohamed等[21]则用70 mg/kg/d CTX静脉注射小鼠1周造模，将5×105个hBMMSCs局部注射至模型小鼠双侧卵巢中，分别在注射后的第2、4、6、8周从体重、激素水平、卵泡储备水平进行评估，结果发现2周时即观察到hBMMSCs治疗组总体重、卵巢重量的增加，并持续到实验结束；治疗组平均卵泡数明显高于对照组，血清 FSH水平较低(P=0.03)，抗苗勒氏管激素(AMH)水平则较高(P=0.005)，提示hBMMSCs恢复化疗药物损伤卵巢的小鼠的激素水平、重新激活了小鼠的卵泡发育。其他一些研究表明，月经血、羊膜、羊水、脂肪等多种来源的MSCs在移植入DOR模型小鼠体内之后，均发现E2、AMH水平升高、FSH水平下降；同时卵泡数量增加、生育能力提高[22-23]。综合起来，MSCs可明显改善DOR模型动物的卵巢储备能力、提高生殖能力。

三、MSCs治疗DOR的临床研究

国内外报道多项MSCs治疗DOR的临床研究。截至2019年5月1日，在国际临床试验登记网站(https：∥clinicaltrials.gov)注册的MSCs治疗DOR临床研究项目共有15个：细胞类型包括自体骨髓MSCs(8项)、异体骨髓MSCs(1项)、脐带MSCs(3项)、自体脂肪组织(1项)、自体脂肪间质细胞(1项)、人胚胎干细胞(hESCs)来源的MSCs样细胞(1项)；给药方式包括卵巢局部移植(11项)、静脉移植(3项)、卵巢动脉移植(1项)；实施的国家包括中国(6项)、埃及(5项)、美国(1项)、约旦(1项)、西班牙(1项)、伊朗(1项)。

2018年的一项临床研究，POF患者纳入标准为18～39岁、闭经持续时间>1年、1～2次FSH≥40 U/L，HRT方案Premarin(0.625 mg/d，25 d)联合Provera(10 mg/d，每月10 d)治疗2年后经临床观察，均无成熟卵泡或未孕(排除染色体核型异常、男方因素，既往手术史或其他相关病理)，将符合条件的16名患者随机分为两组：一组(n=6，2例患者取消UC-MSC移植方案)接受UC-MSC移植加HRT(UC-MSC组)，另一组(n=8)接受UC-MSC联合胶原移植加HRT(胶原/UC-MSC组)。UC-MSCs移植是将5×106个UC-MSCs在阴道超声引导下单侧卵巢局部注入。胶原/UC-MSCs组是将UC-MSCs生长于胶原蛋白支架上，然后同UC-MSCs组进行移植。结果发现，与UC-MSC组比较，胶原/UC-MSCs更有效激活POF患者卵泡生长至排卵前阶段，且有助于卵巢功能的长期恢复，包括卵巢血流量、E2水平和卵泡发育[24]。

MSCs治疗DOR的安全性、有效性已得到临床初步验证，将会开展更多和较大样本的临床研究。

四、MSCs改善DOR卵巢储备的可能机制

1.旁分泌机制：MSCs可以产生大量的可溶性细胞因子、趋化因子、生长因子等[25]促进组织损伤的修复，通常被认为是MSCs参与组织损伤修复的主要机制。众多生物活性物质协同作用形成复杂调控网络，可调控靶细胞内多条信号通路[26]。hBMMSCs移植后可迅速迁移到组织损伤部位，通过旁分泌作用激活组织内源性的特异性干/祖细胞的增殖和分化，参与组织损伤的修复[27]。研究发现，MSCs产生众多生物活性物质，参与免疫调节、抗纤维化、抗细胞凋亡、抗氧化和促进血管新生等进程[28]。诸多研究表明，DOR模型小鼠在静脉输注hBMMSCs或局部组织内输注/埋植人经血间充质干细胞(hMBMSCs)后，表现出更快的动员和更好的归巢，在血液及组织局部可检测到高水平的血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)等多种与细胞生长、炎症及免疫调节相关的细胞因子，修复组织损伤[29-30]。这些细胞因子调节受损组织的微环境，触发血管内皮细胞增殖、迁移和侵入，生成新的血管进而改善局部缺血。归巢的hMBMSCs或人全血来源的MSCs分泌多种抑制凋亡的因子，抑制卵巢局部的炎症和细胞凋亡，从而改善卵巢功能[20，22]。

2.抗氧化作用：研究发现，hBMMSCs治疗可显著提高四氯化碳诱导的肝损伤模型小鼠受损肝脏组织内的SOD水平。在受损肝组织局部，hBMMSCs分泌STC-1，后者调节肝细胞线粒体呼吸链，促进细胞存活，减少由活性氧介导的细胞凋亡[31]。在DOR发病机制中，年龄相关的氧化应激是一个重要环节，在卵泡发育成熟过程中，细胞内ROS和抗氧化剂保持动态平衡；当这种动态平衡被破坏，发生氧化应激，从而导致颗粒细胞、卵母细胞或早期胚胎的细胞凋亡[32]。已有研究表明，hUCMSCs及其分泌细胞因子可能通过抗氧化应激机制降低DOR模型小鼠卵巢内间质细胞、颗粒细胞的凋亡，改善卵母细胞质量及其胚胎发育潜能[33]。

3.分化为组织特异细胞：早在2003年，Ortiz等发现给博来霉素诱导肺损伤的小鼠注射mBMMSCs后，mBMMSCs可以归巢至受损的肺部，分化成上皮样表型的细胞，并减少肺组织炎症[34]。另有研究将绿色荧光蛋白标记的1×104个hEnSCs的局部注射至环磷酰胺诱导的POF模型小鼠双侧卵巢21 d后，采用活体成像和免疫荧光检测技术发现，带有绿色荧光蛋白标记的hEnSCs迁移至卵巢间质中，并且形成了有功能的类间质细胞，促进了卵巢内在生殖干细胞的更新，明显改善模型小鼠的卵巢功能[21]。将2×106个人羊膜上皮细胞(hAECs)麻醉状态下种植至化疗药物诱导的POF模型小鼠双侧卵巢，在7 d至2个月检查发现，卵巢细胞形态学恢复；活体示踪显示，移植的hAECs存活并迁移到卵巢组织，一些hAECs分化为颗粒细胞[23]。这些研究表明，DOR和POF模型小鼠在MSCs治疗后，MSCs可迁移到受损的卵巢组织，继而在卵巢的微环境中分化形成某种(些)具有功能的实体细胞，部分替代或补偿了受损细胞，维护卵泡发育成熟微环境的完整性，改善卵巢功能，促进卵巢储备卵泡的发育。

五、总结与展望

定向诱导多能干细胞分化为卵母细胞，也可能成为临床治疗DOR的有效方案[35]，但该技术刚起步，尚需克服众多的理论及技术障碍。鉴于MSCs来源广泛、免疫原性低、可体外增殖，成为目前临床细胞治疗研究较多的细胞，也是有希望应用于临床的细胞。MSCs对卵巢功能修复的效果已经凸显，初步临床研究的成功给DOR患者的生育带来希望。目前迫切需要开展规范的临床试验和多中心合作，以明确MSCs治疗DOR的适应症、禁忌症、给药方式、剂量、治疗周期，以及合适的细胞类型，客观、真实、完整地评估其有效性和安全性，还要追踪长期安全性和子代安全性。我国已经对干细胞临床研究发布了政策文件，有望通过强化管理，规范干细胞治疗的临床研究。