培养液成份变化对胚胎发育的影响

2019-02-15张宁媛孙海翔

生殖医学杂志 2019年11期

张宁媛，孙海翔

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学科，南京 210008)

胚胎体外培养的目的是保持胚胎的发育质量，增加成功分娩健康婴儿的机会。培养液是胚胎体外发育的能量补给站，培养液成份的改进，维持甚至改善了胚胎在体外培养期间的发育潜能。胚胎体外培养的主要目标是尽可能满足植入前胚胎发育的要求。胚胎在体外条件下，需要不断适应微环境的变化。在有效培养系统下，小鼠胚胎在体外获得了与体内相似的发育速度与质量[1]。现有商品化培养液，能保持胚胎较好的体外发育能力。本文阐述了胚胎培养液的设计策略、培养液的能量代谢与pH缓冲的需求及研究结果，以期优化培养液使用策略，促进胚胎发育。

一、培养液设计策略

卵裂期胚胎通常在输卵管中发育至囊胚后进入子宫腔。在人类子宫中，胚胎发育的主要能量物质(丙酮酸、乳酸或葡萄糖)的浓度，在整个月经周期中几乎没有变化。子宫液中的丙酮酸浓度(0.1 mmol/L)明显低于卵泡期和月经中期输卵管液中的丙酮酸浓度(0.25 mmol/L和0.32 mmol/L)。子宫液中乳酸水平(5.87 mmol/L)也低于月经中期输卵管中的乳酸水平(10.50 mmol/L)。相反，子宫液中的葡萄糖浓度(3.15 mmol/L)明显高于输卵管中的葡萄糖浓度(0.50 mmol/L)[2]。这些观察结果表明，胚胎从处于母体遗传控制之下偏好丙酮酸，到胚胎基因组激活后转移到葡萄糖代谢。囊胚期胚胎表现出更高的代谢需求。

依据着床前胚胎在不同发育阶段对培养条件的特定需要，基于“回归自然”的理念，设计出序贯培养液[3]。各种商品化的人类胚胎序贯培养液，都试图模拟发育中的胚胎不断变化的需要，尽可能接近自然环境。胚胎体外操作过程引起的细胞和代谢的应激，胚胎被迫需要消耗能量来应对这样的外来环境变化；同时人们对输卵管和子宫环境的认识进一步加深，也促进了培养液成份的不断改进。

输卵管对配子、受精和早期胚胎发育具有特异性和显著性的影响。早期宫腔环境对胚胎发育也十分重要。人子宫液中氨基酸浓度为3.54 mmol/L。宫腔中检测到的18种氨基酸的相对浓度不受年龄、体重指数、周期或特定良性妇科疾病的影响，但饮食习惯会影响氨基酸的相对浓度，健康饮食与非健康饮食的妇女的子宫液中，天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸浓度存在差异[4]。

在动物胚胎体外培养过程中，为了尽可能接近生理条件下的培养环境，在培养液中添加生殖道液体。实验结果显示，精子上游液体中添加生殖道液体后，提高了猪卵的受精率；胚胎培养液中添加了生殖道液体后，提高了猪的囊胚质量，囊胚的细胞数量增加、更易孵化。同时，培养过程添加了生殖道液体的胚胎，参与重编程、印迹和发育的基因受体外培养的影响较少，更接近体内发育的胚胎[5]。

单一培养液不同于序贯培养液，将同一成份培养液覆盖了从受精到囊胚的整个着床前胚胎的全程体外培养过程。其设计思路是“让胚胎选择”，即在培养液中，包括了所有浓度的混合物，而胚胎本身会适应和利用它所需要的一切营养和能量，主动控制离子梯度等，并能调节其内部环境。已有文献数据显示，人类胚胎可以在单一培养液中连续培养至囊胚期，而不需要在48 h换液。单一培养液培养为胚胎提供了更稳定的培养条件，胚胎的形态动力学参数也未受影响，可产生更多的优质胚胎[6-8]。

二、培养液的能量代谢

细胞的新陈代谢具有两种功能：一是提供细胞维持细胞内稳态所需的能量，二是提供用于细胞生物合成的物质。体外胚胎发育至囊胚的过程中，胚胎的能量代谢存在发育阶段的特异性[9]。

总体上说，胚胎着床前，添加到胚胎培养液中的主要能量基质有丙酮酸、乳酸和葡萄糖。早期阶段，ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)的代谢相对较低，ATP/ADP(adenosine diphosphate，二磷酸腺苷)比值较高，能量代谢的特点是消耗好氧底物，如丙酮酸、乳酸和谷氨酰胺，葡萄糖利用少。桑椹胚阶段，代谢活动开始急剧上升，ATP/ADP比值下降，对能量的需求增加。细胞分裂的数量增加，蛋白质的生物合成和与囊胚腔形成相关的离子泵作用，成为能量的主要消耗过程。早期的首选营养物质丙酮酸盐的吸收水平下降到非常低的水平，而葡萄糖的吸收水平上升。

具体情况是，在卵丘-卵母细胞复合体中，卵母细胞强调糖酵解和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway，PPP)途径[10]。糖酵解通过己糖激酶的活性提供重要的能量来源。PPP为嘌呤的合成提供原料。己糖胺生物合成途径对于卵丘细胞的细胞外基质扩张十分重要。多羟基化合物途径提供山梨醇和果糖作为其他能量来源，维持氧化还原平衡。卵母细胞和卵丘细胞之间的代谢也存在相互的作用。与卵丘细胞相比，卵母细胞缺乏糖酵解高效代谢葡萄糖、从醋酸酯合成胆固醇和直接摄取丙氨酸的能力。相反，卵母细胞从卵丘细胞中获得糖酵解(如丙酮酸)和胆固醇生物合成(如胆固醇)途径的产物以及丙氨酸。同时，卵母细胞分泌旁分泌因子来促进这一过程。受精后，受精卵以丙酮酸、乳酸等三羧酸为主要能量来源[11]。卵裂期胚胎的代谢以丙酮酸、乳酸代谢为主、并以低水平氧化特定氨基酸为基础。胚胎的代谢模式最初以丙酮酸为能量来源。当胚胎发育到桑椹胚期以后，葡萄糖的消耗量急剧增加，从低糖利用转化为高糖利用。小鼠囊胚中内细胞团(inner cell mass，ICM)几乎完全采用糖酵解方式，滋养细胞(Trophectoderm，TE)则消耗一半葡萄糖转化为乳酸。葡萄糖需求的增加，为囊腔的形成和维持提供了能量来源。囊胚腔的乳酸浓度比周围环境更高。谷氨酰胺和脂质可分别通过三羧酸循环或脂肪酸氧化，作为着床前胚胎发育各阶段的能量来源。脂质代谢在8细胞期之前保持相对稳定，但在8细胞期和桑椹胚期之间突然增加。胚胎的平均耗氧量在第一次分裂时达到峰值，胚胎致密化后耗氧量下降到最低，然后逐渐增加到囊胚期[12]。囊胚中两种细胞ICM和TE的代谢也有差异[13]。与TE相比，ICM细胞的代谢相对安静。而TE比ICM包含更多的线粒体，比ICM消耗更多的氧，也产生更多的ATP。与ICM相比，TE产生囊胚中大约80%的ATP。TE产生能量的主要来源可能是位于TE基底外侧膜上的Na+、K+ATPase(钠泵酶)。

囊胚培养液中存在过量的乳酸盐可能是造成胚胎应激的一个因素。在对107名23～40岁之间的患者进行的一项前瞻性同卵比对试验中，比较了使用低乳酸水平或高6倍乳酸水平的培养液，发现在低乳酸培养液中培养的胚胎，妊娠和持续妊娠的比例更高，提示低乳酸培养液促进人胚胎的体外发育[14]。两个独立的体外受精实验室分别使用序贯培养液(G-Series)或单一培养液(CSCM-NX)、单一培养液(CSCM)或单一培养液(CSCM-NX)，培养胚胎至囊胚期，检测胚胎的非整倍体率，得出了一致的结论。由于CSCM-NX的乳酸浓度较低，通过简单地改变培养液乳酸浓度，使用低乳酸浓度的单一培养液(CSCM-NX)培养的胚胎，整倍体胚胎数量增加了约10%[15]。这提示了培养液中过量的乳酸盐，可能通过影响细胞的纺锤体组装和染色体分离，改变胚胎发育和细胞完整性，增加有丝分裂过程中非整倍体的发生。

三、培养液的pH缓冲

体外胚胎培养需要细胞内稳态，维持胞内pH(pHi)，调节细胞发育。动物实验中，胚胎培养液中添加弱酸DMO(5，5-二甲基-2，4-恶唑烷二酮)，结果显示：无论是在受精卵向2细胞或者2细胞向8细胞分裂期间短时间添加，还是从受精卵持续到囊胚期的长时间添加，尽管囊胚发育和形态没有改变，但均出现囊胚质量下降，细胞数量减少而凋亡增加。第一次卵裂期间添加DMO，不改变种植结局，但胎鼠体重、冠臀长均明显下降；而如果在整个着床前发育过程中持续暴露于DMO中，不但降低胚胎着床率，而且降低胎鼠体重和冠臀长度。由此可见，细胞内pH值的轻微变化，可以显著影响胚胎发育和生存能力，提示着床前小鼠胚胎对细胞内pH高度敏感[16]。适当而稳定的培养液pH值，对维持胚胎持续发育的能力显得至关重要。

pH值的平衡取决于化合物的结合或离解。维持细胞内稳态，最重要的离子是钠、钾、镁、氯和乳酸。在人类卵裂期胚胎中，细胞内pH值为7.2。培养液的pH值主要通过培养箱提供的CO2浓度的平衡和培养液中碳酸氢盐的浓度来调节[17]。升高CO2会降低培养基的pH值，反之则提高pH值。平衡的时间取决于CO2在介质中的扩散和反应的时间[18]。介质的体积、表面积、油层的使用等，都会影响气体交换和平衡的时间。即使提供相同的CO2浓度、相同的基础培养液，在不同的实验室之间可能会产生不同的平衡时间。

在培养液中使用缓冲液有助于稳定pH。不同的缓冲介质，缓冲能力是有差异的。监测碳酸氢盐和HEPES两种缓冲介质的培养液的实时pH值时，可以发现，大气环境下3 min后，碳酸氢盐缓冲介质的pH已经超过7.4，而HEPES缓冲介质在7.3左右可以稳定10 min以上。与单独添加NaHCO3比较，两性离子缓冲显著增加了缓冲能力[19]。最常用的缓冲液HEPES和MOPS，两者的pKa值都是7.2，是两性离子缓冲液中最接近于胚胎pH值的。其中MOPS在酸性范围内的pH缓冲稍好，而HEPES在碱性范围内的pH缓冲稍好。将这两种广泛使用的缓冲液以1∶1的比例(每一种10 mmol/L)结合起来使用，比相同浓度的单个缓冲液，增加了有效缓冲能力。与单独使用20 mmol/L的MOPS或HEPES相比，将两种缓冲液以1∶1的比例组合使用，缓冲范围相似，允许pH在MOPS或HEPES之间缓冲。双缓冲介质(MOPS+HEPES)的培养液，有助于增强体外精子的存活能力。比较8 h与48 h两个时间点，双缓冲介质与单缓冲介质培养液中的精子参数，发现双缓冲介质中的精子活力更好、前向运动精子的比例更多[20]。为了降低对胚胎的应激以及可能的毒性反应，只要维持适当的pH稳定和支持胚胎发育，应尽可能减少缓冲介质的浓度。