宫颈HPV感染与阴道内细菌微环境/免疫微环境的关系

陈思凯，史宏晖，冷金花

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科，北京 100730)

人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)感染是导致宫颈癌的高危因素，严重影响女性身心健康及生殖结局[1]。HPV的感染和自身清除机制与宿主免疫功能的关系目前尚未完全阐明。虽有相关研究和综述涉及到HPV所致宫颈癌与阴道内环境相关[2-3]，但如果能在HPV感染导致宫颈癌前病变甚至HPV感染之前对可能的HPV感染进行预测，同时对HPV感染的高危人群进行及早的干预，这对于宫颈癌的早期预防有着十分重要的意义。本文对HPV感染患者的生殖道菌群与免疫内环境的特点进行文献综述。

一、HPV的传播途径及预防

HPV是一种双链DNA病毒，含有约8 000个碱基对[4]，是一种常见于女性宫颈感染的病毒。其最常见的是16型，会诱发女性宫颈癌[5]，还可以导致尖锐湿疣以及部分咽喉癌[2，6]；HPV可通过皮肤粘膜的微损伤导致鳞状上皮基底层细胞感染[2，4]。常见的传播途径包括母婴垂直传播[7]、性传播[8-9]以及通过破损粘膜和皮肤的接触传播[10]。此外，HPV还可以存在于指甲缝中造成接触性传播[10]，产后的母婴护理也可能是HPV的传播途径[11]。医源性传播，例如经阴道超声探头、结肠镜检查[9]，甚至阴道冲洗[12]也都是HPV潜在的传播途径。新生儿垂直传播造成的HPV口咽感染是造成口腔咽喉癌的重要原因之一[10]。有研究发现人类白细胞抗原G(HLA-G)与多种癌症细胞逃脱免疫监控有关，通过HLA-G的检测可以预测新生儿由垂直传播所致的口腔HPV感染[7]。

现已上市的HPV疫苗包括2价、4价和9价，根据最新的Cochrane系统综述证据表明，HPV疫苗接种可显著降低HPV的感染率，并且相较于未接种者，目前尚无明确证据表明HPV疫苗可导致严重不良事件增加[13]。因此目前来说HPV疫苗是相对安全的。此外有研究指出，血液中的HPV含量并不能有效地反映HPV感染的严重程度[5]。

二、HPV与阴道菌群内环境

阴道内正常菌群中，乳酸杆菌(Lactobacillus)占主导地位[14-15]，可分泌乳酸用以维持阴道内健康的酸性环境[12，16]，并且阴道内菌群谱并非一成不变[17]。此外，乳酸杆菌分泌的细菌素(bacteriocins)、细菌素样拮抗物质(antagonistic bacteriocin-like substances)和生物表面活性剂(biosurfactants)等物质可黏附于阴道粘膜，以抵抗病原体的入侵和破坏细菌的生物膜[8]。

细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis，BV)是女性最常见的阴道相关疾病，对于女性造成身心严重困扰[18]，其发病原因是由于阴道内正常菌群谱的紊乱或外来致病细菌的侵袭，主要特点是乳酸杆菌比例的下降，伴随着阴道内pH值的上升[12]。阴道内其他细菌包括加德纳菌(Gardnerella)、普氏菌属(Prevotella)、梭菌(Clostridiales)、类杆菌(Bacteroides)、阴道奇异菌属(Atopobiumvagina)等[8，19-20]。BV还与多种性传播疾病(STD)有关，包括衣原体、淋病奈瑟氏菌、人类单纯疱疹病毒(HSV)和人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)[21]。BV可改变阴道内菌群结构，减少乳酸杆菌的比例，从而破坏阴道内的弱酸性环境，阴道内pH值的上升与HPV感染和低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)有很强的相关性[12]，通过对BV的诊断可在一定程度上预测HPV的感染风险[22]。在一定程度上，性行为活跃和经常有不洁性行为人群的BV与HPV感染相互促进[23]。一项Meta分析显示BV与HPV感染有关[21]；在BV患者中，高危型HPV(High-risk HPV，Hr-HPV)感染者宫颈上皮内瘤变(CIN)的发生率比低危型(Low-risk HPV，Lr-HPV)感染者的发生率更高，但BV患者与健康人的CIN发病率未发现显著差异[24]。也有研究显示BV可降低HPV自然消除的速率[3]，而以加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)主导的阴道内菌群较其他种类乳酸杆菌有着更快的HPV清除速率[8]。

BV的感染可由多种因素共同影响，包括基因、人种、吸烟、病毒感染或激素水平等[1]。BV患者阴道内普氏菌属(Prevotella)和类杆菌(Bacteroides)产生的神经氨酸酶可破坏宫颈上皮细胞的包膜，其造成的微损伤可使HPV入侵至宫颈组织内[19]。BV可改变宫颈组织内HPV宿主细胞的免疫平衡，并可调节IL-1β和IL-10的水平[15，21]。与BV有关的细菌可诱导组织产生固有免疫相关的细胞因子，包括IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)、巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP-1β)、生长相关原癌基因α(Gro-α)等[25]。BV也可增加病毒感染的可能，例如HIV和HSV，在BV患者中，分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI)的水平明显下降[21]；而在已经治愈的BV患者宫颈涂片中，宫颈粘膜上皮中SLPI水平和CD8+T细胞数量均有上升[26]。对于细胞免疫屏障，BV的有效治疗与CD4+T细胞数量的降低有关[27]，并且IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平也都显著上升[26]。

衣原体感染也可能是HPV感染的危险因素，其机制可能与破坏宫颈粘膜屏障、干扰HPV清除、破坏染色体稳定性和炎症相关反应有关[25]。

综上，BV可通过破坏阴道内免疫微环境，从而影响相关免疫因子的释放，对于HPV或其他病毒的感染有促进作用。现阶段对于BV引发的免疫失衡与HIV感染的关系研究较多[1，27]，但与HPV感染的研究相对较少，有待更多的研究者借鉴其方法进行更进一步的研究。

三、BV与生殖道免疫屏障内环境

如前所述，BV可改变阴道内菌群结构使细菌谱失衡，同时也可改变阴道内免疫内环境。生殖道上皮组成的免疫屏障对许多细胞因子都很敏感，而在BV中此屏障则会遭到破坏[20]。女性下生殖道可自身分泌一系列抗菌物质(Anti-Microbial Peptides，AMP)用以抵抗各类病原体的上行感染[28]。惰性乳杆菌(Lactobacillusiners)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、二路普雷沃尔菌(Prevotellabivia)和阴道奇异菌属(Atopobiumvaginae)可作为阴道内正常菌群，也可作为BV的致病菌[20]。BV的细菌中，阴道加德纳菌(G.vaginalis)、A.vaginae、Mobilunciscurtisii和Prevotellabivia可刺激宫颈内膜、宫颈外膜及阴道粘膜细胞释放IL-6、IL-8、G-CSF、IP-10、MIP-1β、Gro-α等，但乳杆菌属细菌则无此效应[15]。其中Prevotellabivia可通过脂多糖激发的Toll样受体4(TLR4)通路使阴道上皮分泌IL-8和TNF-α；A.vaginae可增加宫颈阴道上皮IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌，并且IL-1β与BV持续感染导致的不利结局有关[20]。对于白细胞介素1受体拮抗因子(IL-1ra)杂合子基因的个体，IL-1ra的功能对于格兰阴性杆菌或G.vaginalis的反应更弱；有IL-1β和IL-8基因多态性的个体对于细胞因子的敏感性会更强，因此BV的患病率就更低[15]。另有研究报道，L.crispatus与詹氏乳杆菌(L.jensenii)共存状态与CD3+HLADR+或CD3+CD4+CCR5+细胞的减少有关[15]。

树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)作为抗原呈递细胞的一种，在阴道内黏膜免疫屏障中发挥着重要作用，而其中浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid Dendritic Cells，pDCs)占生殖道黏膜免疫屏障中DCs的大多数。有研究表明在白色念珠菌感染的BV中，MHC-Ⅱ、CD86、CD80和CD40的表达都有下调，同时pDCs受到免疫调节从而参与BV的相关免疫应答[29]。

目前大多数对于BV和免疫屏障关系的研究重点关注于HIV的感染，HPV相关的研究尚不充分，因此亟需更多的研究者在此领域更多深入研究。

四、HPV与生殖道免疫屏障内环境

HPV表达的抗原蛋白种类及功能包括以下几种，以常见的HPV-16为例，其DNA分子包含7种早期开放阅读框(EORF)和2种晚期开放阅读框(LORF)，分别表达7种E蛋白及2种L蛋白：E1和E2用以初始化病毒复制；E4用以阻止细胞分裂和破坏细胞角蛋白结构；E5可下调I类人类白细胞抗原(HLA-I)分子的表达；E6和E7可下调宿主细胞的干扰素水平[2，30]，同时E6蛋白也可阻止单核细胞向朗格汉斯细胞分化[6]。HPV病毒壳蛋白由L1蛋白五聚体组成，并由L2蛋白相互连接；L1蛋白可作为HPV疫苗的靶抗原，通过向大肠埃希菌(E.coli)导入L1蛋白基因，从而提取出相应抗原用以研制HPV疫苗[31]。

1. 与HPV感染相关的细胞免疫：HPV的感染是通过微损伤导致的鳞状上皮基底层细胞的感染，因此传统的抗原呈递细胞(Antigen-Present Cell，APC)直接接触HPV的机会并不多，但朗格汉斯细胞(Langerhans Cells，LCs)可以直接接触HPV病毒。HPV-16的L1蛋白可以使LCs无法进行免疫应答而产生免疫耐受[2]，且HPV会导致病灶内LCs数量减少[32]，其机制可能是通过HPV感染导致的E钙粘蛋白(E-Cadherin)表达紊乱从而使LCs数量下降[33]；E6蛋白也可阻止单核细胞向LCs的分化[6]。以上这些证据表明HPV可以通过干扰LCs细胞而入侵宿主的免疫系统。

宫颈粘膜的T细胞普遍表达α4β7分子，粘膜定居细胞黏附因子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule，MadCAM-1)用以协助α4β7+T细胞进入组织内并且与CD8+T细胞紧密共存；在HPV感染粘膜的CIN2～3级病变中，CD8+T细胞的数量和MAdCAM-1的表达明显增加，但其增加的程度仍不足以自然消除病灶[5]。在CD8+T细胞转化为细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)后，通过辅助性T细胞1(Th1)释放炎症因子的帮助下识别宿主细胞表达的E6和E7，从而杀死CIN中的宿主细胞[2，34]。因此特异性增强CTLs和自然杀伤T细胞(NKT)的功能来杀死HPV感染的宿主细胞，可为研制治疗性HPV疫苗提供思路[34]。

2. 与HPV感染相关的固有免疫：固有免疫可通过Toll样受体(Toll Like Receptor，TLR)识别病原体从而激活巨噬细胞或DCs，并且可同时调节固有免疫和适应性免疫[35]。巨噬细胞是固有免疫细胞，分为M1型和M2型，分泌炎症因子的巨噬细胞主要是M1型[36]，M1巨噬细胞可分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素(IFN)等炎症因子用以杀伤宿主细胞[2]，有研究表明宫颈组织内TNF-α、IL-6、IL-10含量与组织内的HPV载量无关，但组织内的IFN-γ含量上升可以反映HPV的病毒载量[37]，并且IFN-γ可以诱导CIN向高级别发展[38]。在HPV导致的阴道上皮内瘤变(VIN)中，上皮内CD14+巨噬细胞的数量会增加，而CD14+巨噬细胞的数量越少，瘤变复发的可能性就越小，预后也就越好[39]。

除巨噬细胞以外，NKT也是固有免疫细胞的一种，对于抵抗HPV感染发挥着重要作用。有研究将NKT分为非多样性自然杀伤T细胞(iNKT)与多样性自然杀伤T细胞(nNKT)[38]。CD1d是一种非典型的MHC-I分子，可呈递抗原给iNKT，从而促使iNKT分泌多种细胞因子以抵抗病毒感染与恶变，包括IFN-γ、IL-4、IL-10、和IL-13，但iNKT分泌的IFN-γ可抑制局部组织免疫力从而促进高级别CIN的进展[38]。TLR4在盆腔感染性疾病中发挥着重要的免疫作用[35]，血液中分泌IL-15的DCs可通过TLR4诱导NKT发挥细胞毒作用，完成对HPV宫颈癌细胞的杀伤[40]。近来有研究报道，CD1d和限制性CD1d NKT细胞(CD1d-restricted NKT cells)是固有免疫和适应免疫之间的桥梁，而HPV的E5蛋白可下调CD1d的表达，从而限制NKT的功能导致HPV病毒逃脱免疫监控[41]。

传统观点认为，被病毒感染的宿主细胞可分泌IFN通过阻止病毒的复制以抵抗病毒的入侵，临近细胞可识别IFN并且增强IFN的分泌以进一步加强对于病毒的抵抗[42]。在宫颈HPV感染组织内，IFN-κ和IFN-β都有抵抗HPV活性的作用；在病毒抗原E6和E7刺激细胞产生IFN的情况下，宿主细胞分泌的IFN-κ和IFN-β可将病毒的转录与复制抑制至原来的一半水平[4]。同时有研究发现HPV-16的E6和E2蛋白也会抑制IFN-κ的表达[30]。但另有研究显示IFN-γ则会促进CIN向高级别进展[38]。因此，宫颈组织内IFN的水平和HPV是相互影响的。

综上，在宫颈局部组织的免疫环境中，HPV可抑制LCs功能，同时CTL也可杀死HPV感染的宿主细胞；巨噬细胞和NKT可分泌炎症因子抑制病毒的复制，而HPV也可抑制NKT的功能从而逃脱免疫监控；IFN是抵抗病毒感染和复制的重要细胞因子，但其中IFN-γ却可促进CIN的进展。因此，宫颈组织免疫内环境与HPV感染的关系还需要进一步更深层次的研究。

五、总结

普通女性人群在有过性生活后，一半人会出现一过性HPV感染，而其中90%可自然消退[2]。阴道内微环境的改变与多种因素有关，BV所导致的细菌谱变化可改变阴道内环境从而改变阴道粘膜屏障，对HPV的免疫和自发清除有着重要的影响。此外，生活方式、生活环境和种族差异也可影响阴道内免疫微环境[1]。阴道内细胞免疫和体液免疫的变化都可能影响HPV易感性和感染后病毒的自发清除。其可能的机制是由于阴道内菌群失调或特定的生活方式破坏阴道内免疫微环境，造成免疫细胞功能的失调和免疫因子表达的失调，并且在这些因素之间相互促进的作用下，导致了生殖道内自身免疫屏障和局部免疫功能的破坏，降低了免疫系统对于病毒的免疫功能，在增加HPV易感性的同时也降低了HPV自然消除的速率，结果导致HPV的反复感染或持续感染从而发展成为CIN甚至宫颈癌。目前相关研究并未完全阐明HPV感染和自发清除的机制与阴道内环境紊乱之间的相关性，因此需要更多的研究者来进行更深层次和系统性的研究。