褪黑素调控缺氮胁迫下单针藻中油脂积累的影响

李喜明，赵永腾，余旭亚

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明，650500)

化石能源日益短缺，温室气体效应日趋严重，开发清洁可再生能源成为热点，环境友好的生物柴油极具潜力[1]。作为制备生物柴油的原料，微藻因光合效率高、环境适应能力强、生长周期短、油脂含量高等特点，成为近些年来的研究热点[2]。

培养条件和营养成分的改变，尤其在强光照、高温、营养成分缺乏等胁迫条件下，可直接影响微藻的生长及油脂的合成[3-11]。此外，胁迫条件结合外源添加化学诱导物或植物激素，是有效促进微藻细胞中油脂积累的另一工程策略[4,12]

褪黑素(melatonin，MT)是一种必需氨基酸——色氨酸的衍生物，最初发现于牛松果体中[13-14]。MT作为广谱的抗氧化剂以及自由基清除剂，可直接淬灭植物中多余的活性氧(ROS)，以及通过提高细胞内抗氧酶活性进一步减少氧化应激导致的细胞损伤[15]。非生物胁迫条件下，MT作为调节剂，可以通过调节光合作用和新陈代谢影响植物的生长和糖代谢[14]。WEEDA等[12]的研究结果表明，MT可通过参与细胞中赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)的信号转导途径，调节植物抗衰老作用。此外，缺氮和高光照胁迫下，MT通过诱导一氧化氮水平调控促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)和环腺苷酸(cAMP)信号通路以激活相关转录因子从而促进与虾青素和油脂合成相关基因的表达，进而提高微藻中次级代谢产物的积累[16]；MT也可通过调控信号分子一氧化氮(NO)和水杨酸(SA)的水平来促进雨生红球藻中虾青素的积累[17]。MT虽在植物功能调节方面已取得进展，但其对微藻生长及油脂合成的调节作用鲜有报道。

本文研究了MT诱导联合缺氮胁迫培养对单针藻Monoraphidiumsp. QLY-1的生物量、油脂、碳水化合物、蛋白质以及脂肪酸组成的影响，并考察了MT诱导下相关信号分子与油脂合成的关系。同时，探索了外源添加MT诱导油脂合成相关酶基因的表达与油脂积累的关系，旨在为研究微藻油脂积累提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单针藻Monoraphidiumsp. QLY-1筛选、保存于本实验室；褪黑素、ELISA试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司；葡萄糖、三氯甲烷、甲醇均为分析纯，购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

TS-2012GZ恒温(恒湿)振荡摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司；TDL-40B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；FD5-12冷冻干燥机，美国金西盟国际集团中国分公司；SmartSpec plus分光光度仪，上海伯乐生命医学产品有限公司，ABI-7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统(ABI)公司。

1.3 培养方式

异养培养：以BG-11为基础培养基，添加10 g/L葡萄糖，黑暗培养。培养温度(25±1)℃，摇床转速150 r/min，培养周期10 d。

自养诱导：以缺氮BG-11为基础培养基并设置为对照组，添加MT至终浓度达到1 μmol/L作为实验组诱导处理[3]，光照100 μmol photons/(m2·s)下培养,培养温度(25±1)℃，摇床转速150 r/min。每组设置3个平行。

1.4 生物量和油脂含量的测定

每天离心(3 500 r/min，10 min)收集藻细胞，记录藻液体积(V，mL)，将湿藻体于-80 ℃下过夜后进行真空冷冻干燥至恒重(W，g)。干藻粉(WD，g)∶石英砂(1∶2，质量比)研磨20～30 min，以V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1，作为油脂提取溶剂，油脂提取采用具体操作步骤见ZHAO等[11]，并记录油脂重量(WL，g)。

生物量/(g·L-1)=W/V×10-3

(1)

油脂含量/%=WL/WD×100

(2)

1.5 碳水化合物含量的测定方法

10 mg干藻粉置于15 mL离心管中，加入0.5 mL乙酸，80 ℃水浴20 min,再加入10 mL丙酮于离心管中，3 500 ×g，离心10 min。弃去上清液，收集藻细胞，吸取4 mol/L三氟乙酸2.5 mL重新悬浮，煮沸4 h，10 000 ×g，离心3 min，取100 μL上清液于新试管中，再加入900 μL硫酸(15 mL)∶水(7.5 mL)∶苯酚(0.15 g)，煮沸20 min。在490 nm处检测其波长，根据葡萄糖的含量与OD490nm的关系计算碳水化合物的含量[11]。

1.6 蛋白质含量的测定方法

称取干藻粉10 mg于试管中，并加入NaOH溶液(1 mol/L)200 μL，80 ℃水浴10 min，加入800 μL蒸馏水，混合离心30 min，12 000×g，并将上清液转移至新离心管中，重复上述步骤提取2次，合并3次提取液，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量[11]。

1.7 内源性植物激素和关键酶基因的测定

准确称取干藻粉0.1 g，按照质量(g)∶体积(mL)=1∶10加入匀浆介质(磷酸缓冲液PBS，0.1 mol/L，pH 7.0～7.4)，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，3 500×g，离心10 min。取上清液用生理盐水按1∶9比例稀释成10%体积分数的组织匀浆进行测定，利用ELISA试剂盒测定植物激素脱落酸ABA和赤霉素GA的含量。

利用Primer 5.0设计出相关酶基因的荧光定量特异性引物。由上海生工合成rbcL、accD、pepc(表1)，离心收集第1、第2、第3、第4天的藻细胞于2 mL离心管中，于-80 ℃冰箱保存，Trizol法提取藻细胞的总RNA，由逆转录试剂盒合成cDNA。

表1 单针藻Monoraphidium sp. QLY-1油脂合成相关酶基因的qRT-PCR引物Table 1 Gene involved in lipid biosynthetic pathway in and their respective primers used in qRT-PCR expression analysis

利用普通PCR实验初步验证引物正确性。以cDNA为模板进行荧光定量PCR。梯度稀释cDNA模板浓度用于制作荧光定量PCR标准曲线，实验组与对照组的每个样品各设置3个重复，本实验采用荧光染料SYBR进行定量，随着qRT-PCR的进行，SYBR染料与双链DNA结合，其荧光信号由仪器检测，从而达到定量的目的。荧光定量PCR条件为：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循环数35。扩增效率在90%～ 105%，R2>0.990为理想状态，根据2-△△T法计算各基因的表达量，以此反映各基因的表达水平。

1.8 统计分析

所有实验数据都是通过ANOVA(SPSS 19.0)一步法分析实验数据。最小显著差异进行多重比较，检验调查不同实验的组间差异，且当*P<0.05具有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 缺氮条件下MT对单针藻Monoraphidium sp. QLY-1细胞生长和油脂含量的影响

如图1-a所示，缺氮条件培养下，微藻生长缓慢，最高生物量为0.89 g/L。MT进行诱导后，最高生物量达到0.95 g/L，高于对照组，低于BG-11培养下的最高生物量(1.121 4 g/L)。这一结果表明添加外源MT可促进微藻在缺氮培养条件下的生长，这可能是由于MT提高了微藻利用细胞内氮源的能力从而维持其在缺氮条件下的生长[4]。

图1 缺氮条件下MT对单针藻生物量(a)和油脂含量(b)的影响Fig.1 The effect of MT on the biomass production(a) and lipid content (b)of Monoraphidium sp. QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

BABU等[5]报道在小球藻中氮限制条件下联合吲哚乙酸和胺鲜酯的诱导，微藻的生物量得以提高。这说明在缺氮胁迫或氮限制条件下，添加化学诱导子可有效提高微藻的生物量。

在缺氮条件培养下，微藻中的油脂含量最高为42.06%，高于BG-11培养下的最高油脂含量(33.77%)， MT进行诱导后，微藻中的油脂含量比对照组提高了1.22倍(图1)，且高于正常培养条件下褪黑素诱导单针藻的油脂含量(49.6%)[19]。这一结果表明，缺氮胁迫可有效提高微藻中油脂的含量，而MT可进一步促进缺氮条件下微藻中油脂的积累。这可能是因为外源添加的MT会强化微藻中蛋白质、碳水化合物与油脂合成的内在联系， MT诱导和光诱导的联合培养，可使微藻中蛋白质和碳水化合物的含量发生改变进而促进油脂的积累[18]。因此，MT诱导缺氮胁迫下单针藻中油脂的积累可能与藻细胞中化合物之间的转化有关。

图2 缺氮条件下MT对单针藻中碳水化合物含量(a)和蛋白质含量(b)的影响Fig.2 The effect of MT on the carbohydrate(a) and protein(b) content of Monoraphidium sp.QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

2.2 缺氮条件下MT对单针藻Monoraphidium sp. QLY-1中碳水化合物含量和蛋白质含量的影响

光合作用中所固定的碳可用于合成油脂，碳水化合物和蛋白质等富含能量的物质。图2-a显示，随着培养时间的延长，对照组与实验组中微藻碳水化合物的含量呈下降趋势。而碳水化合物是光合作用的初期产物，缺氮胁迫下碳水化合物含量降低，可能与油脂积累有关；外源添加MT诱导后，碳水化合物含量低于对照组，藻细胞内油脂含量显著增加。在油脂大量合成阶段，单针藻QLY-1细胞内碳水化合物含量显著降低，这一结果与 MILLER所报道的一致[20]。

在单针藻QLY-1生长过程中，蛋白质的含量呈先稳定再下降的趋势。异养小球藻接种于自养培养，蛋白质含量在数小时内迅速积累[21]。而在胁迫条件下，如高光照和缺氮，导致Nannochloropsisoceanica蛋白质水平迅速下降[22]。外源添加MT使油脂积累增加，蛋白质大量消耗，导致蛋白质含量降低。CHOKSHI等[6]研究显示，Acutodesmusdimorphus在缺氮胁迫下，其蛋白质和碳水化合物含量均呈明显下降趋势。MT联合缺氮胁迫条件下，单针藻QLY-1中碳水化合物含量和蛋白质含量可能与油脂合成的复杂代谢过程相关联，其内在联系及相关机制值得进一步开展研究。

2.3 缺氮条件下MT对单针藻Monoraphidium sp. QLY-1中植物激素含量的影响

脱落酸ABA和赤霉素GA，是植物和微藻中控制生物胁迫和非生物胁迫的两种重要的植物激素和生长调节剂[7-9,23]。缺氮胁迫下，微藻中ABA含量在第一天显著增加，添加外源MT诱导后，ABA含量呈缓慢上升趋势但低于对照组(图3-a)。

图3 缺氮下MT对单针藻中脱落酸ABA(a)和赤霉酸GA(b)含量的影响Fig.3 The effect of MT on abscisic acid (ABA) (a) and gibberellic acid (GA) (b) of Monoraphidium sp.QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

结果表明，MT促进缺氮胁迫下微藻中ABA的分解代谢。SULOCHANA等[9]报道微藻Scenedesmusquadricauda在缺氮条件下，细胞内ABA含量第1天显著增加。此外，在缺氮胁迫下，GA含量数小时内迅速增加，而后保持在13 μg/L上下，添加外源MT诱导后，GA含量呈上升趋势(图3-b)。这一结果表明，MT可促进藻细胞内GA的合成。ZHANG等[8]研究发现，MT的作用主要是通过ABA和GA4的生物合成与分解代谢，从而缓解高盐胁迫对黄瓜种子萌发的作用。通过MT促进缺氮胁迫下单针藻中油脂的积累，可能与其调控GA合成和ABA分解代谢相关，这一相关效应的分子机制还有待研究和探索。

2.4 缺氮条件下MT对单针藻Monoraphidium sp. QLY-1中与油脂合成相关酶基因表达量的影响

通过上调油脂合成相关酶基因的表达可促进单针藻中油脂的积累[18]。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)作为油脂合成第一步中的关键酶，催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，而accD是编码乙酰辅酶A羧化酶的异侧β单元的一段DNA序列[16,24]。在MT处理下，accD表达水平在诱导第2天和第4天时分别比对照组提高了1.98和1.75倍(图4)，accD表达量的增加与微藻中油脂的积累一致(图1-b)。黄腐酸诱导条件下，单针藻Monoraphidiumsp. FXY-10中的accD表达与油脂合成呈正相关[18]。此外，外源MT上调了rbcL的表达水平，较对照组提高了1.2倍，且藻细胞生物量出现了相应的增加(图1-a)，外源添加MT可能促进了核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCO)对CO2的固定[24]。

图4 缺氮下MT对单针藻内基因相关表达量的影响Fig.4 The effect of MT on relative expression level of gene of Monoraphidium sp.QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是油脂积累合成途径上的另一关键酶。缺氮联合MT诱导下，pepc的表达水平低于对照组，说明MT可能抑制该酶催化磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的转化，从而使磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮方向转化，此时，accD基因表达量随之升高，进而促进油脂积累。FAN等[25]研究表明，缺氮胁迫下，微藻中pepc8086的表达水平在生长阶段末期增加了1.4倍，而在油脂积累极端呈下调趋势。综上，缺氮胁迫下，外源MT促进单针藻中油脂的积累与上调accD、rbcL及下调pepc有关。这与之前李大菲等[19]利用褪黑素诱导单针藻中油脂积累的研究结果一致。

3 结论

本文研究MT联合缺氮胁迫可以进一步提高单针藻Monoraphidiumsp. QLY-1中的油脂含量，且比单一缺氮胁迫下提高了1.22倍。MT促进微藻中油脂的积累与调控信号分子GA的合成及ABA的降解有关。MT显著上调了accD和rbcL的表达水平，与微藻中油脂的合成呈正相关，同时下调了pepc的表达量。本研究初步阐明了缺氮联合MT诱导微藻积累油脂的分子机制，为基因工程改造微藻提供了一定的理论基础。MT与其他信号分子调控相关转录因子，促进缺氮胁迫下微藻油脂积累的相关机制有待进一步研究。