重组酶聚合酶等温扩增技术在食品安全检测领域的应用

兰海鸥，柯义强，马咸莹，程浩，丁功涛，李明生，陈士恩，马忠仁，魏嘉*

1(西北民族大学，生物医学研究中心，中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州，730030)2(西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州，730030)

随着全球经济的发展，进口贸易的增多，食品安全检测也日趋严格。常用于食品安全检测的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，是目前大部分检测机构及医学实验室都在使用的常规技术。然而该技术需要昂贵且精密的控温设备，耗费较长时间，在现场检测中不具备优势，因此，我们需要更加简便的技术来提高检测效率。

等温核酸扩增技术的问世为快速检测带来新的曙光。目前开发出来的等温扩增技术包括环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)、自主序列复制与依赖核酸序列性扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、单引物等温扩增(single primer isothermal amplification, SPIA)、链置换扩增技术(strand displacement amplification,SDA)、信号介导的核糖核酸扩增技术(sigal-mediated amplification RNA technology,SMART)、依赖解旋酶的等温扩增技术(helicase-dependent isothermal DNA amplification, HAD)、滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)、快速等温检测放大技术(rapid isothermal detection and amplification,RIDA)、切刻内切酶核酸恒温扩增(nicking enzyme mediated isothermal amplification, NEMA)和重组酶聚合酶扩增技术等[1]。文章对重组酶聚合酶等温核酸扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)及其在食品安全检测方面的应用进行综述。

RPA技术是聚合酶链式反应(PCR)的一种替代品，可快速、便捷地进行核酸检测分析[2]。RPA与PCR扩增一样具有特异性，但速度更快，结果通常在3～10 min生成。与PCR不同的是，RPA反应不需要热变性，因此不需要昂贵的热循环设备。RPA对操作温度要求并不严格，反应在37～42 ℃下工作最优，比其他等温扩增技术需要的温度要低，能在广泛的环境温度下工作[3]。RPA可以在多种应用中取代PCR，如传染病诊断和食品安全检测，它非常适合于现场、护理点和其他设备缺乏的环境，特别是对于检测速度需求较高的情况下。

1 RPA技术介绍

1.1 反应原理

RPA技术的整个反应体系包含噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、寡苷酸引物、单链核酸结合蛋白(single-stranded DNA-binding proten,SSB)、DNA聚合酶，DNA模板、ddH2O和Mg2+等[4]。其扩增原理是恒温条件下，重组酶与长约 30～35 nt的寡核苷酸引物结合形成复合物，并在双链DNA模板中寻找靶位点，重组酶打开双链DNA，引物与同源序列发生链交换反应形成D状环，SSB随即结合到被置换的DNA链，防止引物解离，重组酶解离后引物3’端暴露并被链置换DNA聚合酶识别，在DNA聚合酶的作用下DNA扩增反应启动；引物与双链DNA配对形成复制所需的3’羟基末端，并在聚合酶的作用下进行复制延伸，继续DNA合成过程并完成2个引物的扩增，最后形成完整的扩增子。

1.2 引物设计

RPA引物设计原则：

(1)引物长度最长是45 bp，最好为30～35 bp，过短会影响重组酶活性。

(2)5’端为3～5个核苷酸，且避免出现连续的聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进扩增片段的重组。

(3)3’端最好为胞嘧啶和鸟嘌呤，有助于聚合酶的稳定结合，提升引物扩增性能。

(4)引物中避免出现特殊序列，如避免出现回文序列和连续的重复结构。

(5)引物设计时尽量避免容易形成发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。

(6)GC含量过高(>70%)或过低(<30%)都不利于RPA扩增[6-8]。

1.3 技术特点

RPA技术与传统的PCR扩增相比,在便捷性以及高效性上有显著的优势，与PCR技术相比有以下特点：

(1)反应能够在恒温条件下进行。尽管RPA的反应模式与PCR相似，但不同的是PCR反应需要加热使DNA模板变性，而RPA不需要，在37～42 ℃的条件下，利用重组酶引物复合体扫描双链DNA，促使DNA链上同源位点的互换。

(2)耗时短。RPA反应速度快，能在5～10 min完成检测。在许多情况下，没有经过专门训练的人就可以采集样本，进行实验，并在半小时内得到结果。检测速度远胜于其他等温扩增技术。

(3)操作简单。RPA扩增的基础体系含有DNA扩增所需的所有试剂，只需加入引物和模板就可以反应，不需要复杂的样品前处理，这大大提高了操作效率，避免繁琐的实验步骤带来可能性的误差。

(4)不受场地的限制。PCR扩增需要专门的PCR仪，RPA技术由于对温度要求低，甚至可以用人体温度进行，并可以在条件较为简陋的地方进行检测。

(5)高灵敏性。在复杂样品中，RPA技术可以检测单拷贝的DNA和几十个或更少拷贝数的RNA分子，而不需要事先进行核酸纯化和富集[9-11]。

1.4 操作过程

含有重组酶及聚合酶干粉的反应管中分别加入反应缓冲液、上下游引物以及模板DNA，用蒸馏水补至总体积，充分混匀，加入醋酸镁溶液，上下颠倒8～10次混合均匀，瞬时离心后，放置于所需温度的水浴锅中反应10～15 min[12-15]。

2 RPA及衍生技术

2.1 直接重组酶聚合酶扩增技术(Direct-RPA)

Direct-RPA是一种快速、灵敏的检测方法。该技术不需要复杂的样品前处理环节，常温下就能够对样品中的目标基因进行扩增，简化了过程分析，在15～40 min的反应时长内能完成实验要求，远低于NASBA、HDA等技术的时长要求。它既不需要PCR所依赖的热循环仪器,也不像环介导等温扩增技术(LAMP)需要提前准备预变性的模板[16]。Direct-RPA具有快速、灵敏、简单等优点，是RPA系列技术的基础，但也有较明显的缺点，如产物的检测需要进行凝胶电泳，与其他等温扩增技术相比，检测步骤比较麻烦。

2.2 重组酶聚合酶扩增侧流免疫技术(RPA-LFD)

侧向流动免疫试纸条(lateral flow device，LFD)是目前用于定性和半定量检测的简单装置。RPA-LFD是指在RPA技术结合LFD的一种联用技术，两者相结合可建立一种快速灵敏的现场检测系统[17]。RPA-LFD基于RPA扩增原理，用带生物素标记的引物和6-羧基荧光激素(6-FAM)标记的探针与靶核酸进行扩增反应[18]，最终形成的扩增子既带有FAM基团又被生物素标记。LFD前端带有FAM抗体的纳米金粒，检测线上带有生物素抗体，将产物滴到试纸条上，扩增子上的FAM基团与FAM抗体反应，检测线处的生物素抗体与扩增子上的生物素结合。最终，检测线上显示深紫色条带，未被捕获的产物与质控线线处的特异性抗体结合显示深紫色条带。RPA-LFD检测能在15～20 min完成，25～45 ℃的环境中便可进行，因此，可用一些简单的加热装备，如电热水器等便可实现精确检测。RPA-LFD检测结果能在横向流动试纸条上显示，裸眼便可观察，即使是非专业人员也可以直接分析结果，非常适用于现场快速检测，尤其在经济条件差资源缺乏的区域，具有更好的应用前景[19]。

2.3 重组酶聚合酶扩增酶联免疫吸附技术(RPA-ELISA)

酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是抗原抗体的特异性反应，指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法[20]。RPA-ELISA技术是在RPA技术的基础上结合ELISA技术发展起来的用于检测核酸扩增产物的新型分析检测手段，综合了RPA、ELISA两种技术的特点，在特异性、灵敏性等方面表现出优异的特点、而且操作过程简单，结果不需要电泳检测和RPA产物纯化，较短时间内可以完成整个检测过程[21]。同时，能在数小时内对大量待检样品进行筛选和鉴定，适用于资源匮乏的现场快速检测，是一种有效的联用检测技术。但RPA-ELISA也存在缺陷，如重复性差，容易出现假阳性等[22]。

2.4 实时重组酶聚合酶扩增技术(real-time RPA)

Real-time RPA，即实时荧光定量RPA，是RPA基础反应体系与荧光探针结合起来的一种联用技术。与实时定量PCR比较，两者具有相同的灵敏度与特异性，然而实时荧光定量RPA的检测过程所需时间明显短于实时荧光定量PCR，即实时荧光定量RPA所需时间是7～15 min，实时荧光定量PCR则需耗时约90 min，且实时荧光定量PCR的实验操作设备较复杂、昂贵，而且所占空间大、不便携带。此外，实时荧光定量PCR不仅需要一个热循环过程而且实验操作步骤复杂，而实时荧光定量RPA实验操作 37～42 ℃ 的恒温条件下就可进行，不需复杂的操作程序[23]。用双标记寡核苷酸探针检测目标扩增产物，该探针的5’末端含有荧光基团Tamra或FAM)，3’末端含有猝灭基团。当探针与被扩增的靶DNA结合时，外切酶Ⅲ切割基本位点，荧光基团和猝灭基团被分离，从而产生出与扩增目标DNA数量成正比的荧光信号，荧光强度也会随着其扩增而增强[24]。荧光强度信号实时检测由荧光信号检测器或扫描仪完成，目前有针对荧光定量RPA技术的简易便携荧光检测设备。该技术敏感性强、特异性高，检测时间短，已有不少报道利用该技术建立食品安全快速检测的方法。

3 RPA技术在食品安全检测领域的应用

目前，RPA技术在国内外已经有大量的报道，涉及食品安全检测以及临床诊断等方面，并且在快速便捷检测等方面优于PCR检测。RPA技术在食品安全领域的应用主要包括食源性病毒、食源性致病菌、动物源性成分及转基因成分检测等方面。

3.1 食源性致病菌的RPA检测

沙门氏菌是引起世界各地食源性疾病暴发的最常见病原，许多流行病学调查将沙门氏菌爆发的源头归咎于家禽和家禽副产品，包括蛋类[25]。GAO等[26]建立了一种快速检测贝类中沙门氏菌的RPA-LFD检测方法，在30～45 ℃下，仅需要8 min的扩增就能达到扩增子的检测阈值。该方法具有良好的特异性，每次反应都能达到100 fg DNA(20 μL)的灵敏度。且不需要昂贵的设备，可作为野外条件下贝类和其他食物中沙门氏菌的检测试剂盒。KERSTING等[27]将芯片技术与RPA技术结合，建立了一种能够在芯片表面检测淋球菌、肠道沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，酶反应在20 min完成，检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌10个菌落形成单位和淋球菌100个菌落形成单位，该方法对于护理点检测和基于核酸的简化和小型化诊断是有效的。KIM等[28]以牛奶为研究对象，建立了RPA方法检测其中的沙门氏菌，5 min后裸眼观察检测结果。整个实验过程在30 min即可完成，得出牛奶中的沙门氏菌检出限为100 CFU/mL(每毫升样品中含有的细菌菌落总数)，再次印证了RPA具有高灵敏度的特点。LIU等[29]以牛奶和鸡胸肉为研究对象，建立了一种RPA-LFD快速检测方法，检测样品中的沙门氏菌，并与PCR-LFD的检测结果比对，结果显示RPA-LFD的检出限为1.05×10 CFU/mL，而PCR-LFD的检出限为1.05×105CFU/mL，因此RPA-LFD的检出限比较低，灵敏度高。由此可见，RPA技术能够为食源性致病菌的检测提供一种简便的方法。

3.2 食源性病毒的RPA检测

食源性病毒指以食物为载体并经粪口途径传播而导致人类感染、患病的病毒。作为食源性疾病的重要病原体，微量的病毒即可引起相关疾病的发生，其中不乏传染性强、流行范围广、危害严重的疾病。WANG等[30]基于RPA技术结合侧流层析技术LFD建立了一种检测口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的方法。在38 ℃ 条件下，用特异性引物和探针，在20 min成功扩增了口蹄疫病毒基因组2B基因的一个区域。该方法进一步验证了RPA技术具有操作简便、特异性好、灵敏度高等的优点，且不需复杂仪器，适用于基层实验室和现场的口蹄疫病毒快速筛查检测。YEHIA等[31]开发了用于检测H5亚型流感病毒的血凝素基因的定性逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription recombinase polymerase amplification,RT-RPA)测定法。将结果与实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行比较，前者在7 min能完成检测，而后者至少需要90 min才能完成。总之，RT-RPA比RT-PCR更快，并且易于在便携式设备中操作。而且，它们具有同等的敏感性和特异性。EI等[32]以家禽及肉制品中H7和N9亚型流感病毒为研究对象，建立了反转录实时荧光定量PCR(RT-qRPA)方法。该方法分别可最低检测到10个H7亚型病毒RNA或100个N9亚型病毒RNA，进一步表明RPA技术具有高灵敏性的优点。食源性病毒威胁人类健康，因此其检测对食品安全体系的完善具有重要的意义。RPA检测方法的建立为食源性病毒的检测提供了新的方向。

3.3 肉类掺假检测

肉类食品是人们生活中最重要的生鲜类食品之一，随着生活水平的提高，对肉品质的需要也越来越高，近年来，国内外市场上的肉制品掺假事件频繁发生，这些不法行为不仅破坏了公平贸易，给消费者带来经济损失，更重要的是引起了食品安全等方面的问题。郭燕华等[33]根据猪源线粒体细胞色素B基因序列设计了2对RPA引物，筛选了1对可用于扩增的引物，建立了基于重组酶聚合酶介导的等温核酸扩增检测方法，结果显示，30 ℃等温扩增条件下，RPA引物的特异性良好，检测灵敏度可达0.1 ng/μL，该方法快速简便，具有较高的特异性和灵敏性，适用于快速检测市售生鲜肉中的猪源性成分。吴昊等[34]根据家猪线粒体细胞色素B的核苷酸序列建立了一套利用Real-time RPA技术进行肉及肉制品中猪源性成分的检测方法。此方法能够检测出肉及其制品中低至0.2% 的猪源性成分，且能够在恒温条件下(40 ℃)15 min内完成反应，是一种新型、简单、高效的检测方法，对实现快速便携式的猪源性成分检测具有重要意义。综上所述，RPA技术在动物源性检测方面具有简单高效等优点，为市售生鲜肉制品掺假提供了快速便捷的检测方法。

3.4 转基因检测

随着转基因技术的不断发展，其在农业技术方面的应用也越来越广泛，转基因食品也走向市场，在转基因食品的监测方面，监管部门也面临越来越大的压力。贾玄[35]针对转基因水稻建立了一套利用RPA技术的检测方法，包括RPA-Basic、RPA-LFD、实时荧光定量RPA(RPA-Exo),结果显示，该检测方法相较于传统的PCR具有更高的灵敏性，检测速度方面也优于传统PCR，在15～40 min能够检测出结果。李凯等[36]以转基因玉米TC1507和MON89034两个品种为研究对象，在实时荧光定量RPA检测方法的基础上，建立了双重RPA检测方法，结果显示，RPA荧光检测方法可以对这两种转基因玉米进行双重检测。XU等[37]基于花椰菜花叶病毒35S(camv-35S)启动子和农杆菌NOP合成酶基因(NOS)终止子等在转基因作物中的调控序列，设计了两套RPA引物，建立了用于转基因作物筛选和检测的实时RPA检测方法。该方法可在15～25 min可靠地检测出样品中的100个拷贝的目标分子。此外，还成功地将实时RPA检测方法用于4种主要转基因作物(玉米、水稻、棉花和大豆)的DNA扩增和检测。这种新的扩增方法大大缩短了检测时间，简化了反应过程，为转基因作物的快速检测提供了一种有效的方法。CHANDU等[38]以转基因RR2Y大豆为研究对象，建立了一种RPA的现场检测方法，以大豆样品中内源Lec基因作为对照，反应开始后大约5～7 min，Lec调控的反应在所有情况下均产生阳性信号。研究表明，这种现场检测方法同样适用于未经训练的人员对样品进行快速简单的测试。RPA技术为转基因食品的检测提供了快速便捷的方法。

3.5 过敏原基因检测

随着食品行业的发展，过敏食物的增多，过敏性疾病已经成为全球性的问题，并引起各界广泛的关注，据报道，约有90%的过敏反应是由花生、鸡蛋、牛奶、果仁、贝类、大豆和小麦引起的，其中以花生为过敏原引起的过敏反应最为严重，SANTIAGO-FELIPE等[39]建立了一种RPA-ELISA检测技术，同时检测榛子、花生、大豆、番茄和玉米中的过敏原结果表明，每个分析物的检出限为 1.3～5.3 μg/g，与PCR-ELISA的灵敏度和重复性相比，RPA-ELISA都优于前者，且RPA-ELISA技术更适合应用于偏远地区等资源匮乏的环境。JAUSE-TRUBIO等[40]以羽扇豆为研究对象，建立了核酸适体-重组酶聚合酶等温扩增(Apta-RPA)的方法，利用选择的DNA适体的亲和力和特异性，对抗过敏性β-凝集素过敏原进行等温扩增超灵敏检测。将磁珠作为固相与Apta-RPA检测相结合，总测定时间从210 min减少到仅25 min，检测限为3.5×10-11mol/L，证明了快速和超灵敏的通用方法可以与任何适配器一起使用。RPA方法的建立为食品中过敏原的检测提供了新的思路。

4 结论

RPA等温扩增技术具有许多优点。这种反应没有热循环的需要，可使用简单设备，如加热器或烤箱，价格低廉，可以进行最低限度的维护控制。具体来说，RPA具有恒温、较低温度、扩增时间短、可靠性和简单性等特点。核酸扩增产物的测定还具有灵敏度高等优点，在食品安全检测领域具有一定的应用价值。它提供了一种能够检测潜在食物威胁因素的方法，如过敏原、转基因生物或病原体。传统检测技术由于耗时长，设备复杂，因此不利于现场快速检测，已不能满足食品安全检测的更高需求，因此建立一种快速、便捷、灵敏、特异的检测方法十分重要。RPA作为一个新兴的分子检测技术，迄今为止，不仅在医药学等方面应用较多，而且在食品安全检测方面的研究也初有成效，随着RPA技术不断应用与研发，未来RPA将朝更加快速、便捷、敏感、特异的方向发展，给食品安全检测的研究带来新的曙光。