靶向端粒与POT1蛋白的小分子药物研究进展

尹晓刚

（浙江工业大学，浙江 杭州 310014）

端粒是染色体的保护性末端，存在于真核细胞染色体之中，与端粒结合蛋白一起构成了染色体“帽子”结构[1-2]，起着保持染色体完整，控制细胞有丝分裂的作用[3-4]。端粒的功能异常会导致细胞有丝分裂的异常，从而使增殖活性降低，诱导细胞凋亡，是抗肿瘤靶点研究的重要内容。一系列证据表明肿瘤细胞中的端粒能够以自身为模板，通过活化的端粒酶进行自我复制、延长，是导致肿瘤细胞永生化的主要因素[5]。

端粒是由端粒DNA与端粒复合蛋白相结合的复合结构，端粒复合蛋白（shelterin）在端粒长度调控和保护端粒的DNA损伤反应中起着至关重要的作用。端粒复合蛋白由六种蛋白组成，分别为端粒重复序列绑定因子TRF1、TRF2，TRF1相互作用蛋白TIN2，端粒保护蛋白POT1，TIN2与POT1连接蛋白TPP1，以及受体活化蛋白RAP1[6]。其中对POT1的大量研究中发现：POT1的表达与端粒结构的稳定、端粒悬突G-四链体的形成息息相关[7-8]。端粒保护蛋白POT1是一种高度保守的蛋白，由N端悬突结合结构域与C端蛋白结合结构域组成，分别结合端粒末端G-Overhang（端粒3’端悬突结构）与端粒蛋白TPP1，具有维持端粒结构稳定，限制G-Overhang长度等作用。POT1最为重要的作用是能够诱导G-Overhang反向折回端粒DNA双链结构，将双链其中一段自身链置换出来，互补链进行配对，形成端粒结构中独有的D-Loop（Displacement Loop）与 T-Loop（Telomere Loop），将活性的端粒末端DNA隐藏，从而维持端粒结构的稳定。POT1蛋白的缺失或低表达对于维持端粒结构稳定、染色体遗传稳定性乃至细胞产生重大的影响（Figure 1）。

Figure1 The structure of the ternal of telomere

1 POT1蛋白的生物学意义

1.1 POT1蛋白缺失导致端粒结构破坏

存在于端粒末端的蛋白POT1是形成末端结构D-LOOP与T-LOOP的关键蛋白，POT1蛋白的缺失将导致D-LOOP与T-LOOP之上的键合强度降低，使该结构不稳定，重新转变为自由单链结构，使得通过形成D-LOOP与T-LOOP结构被隐藏起来的端粒3’端悬突结构重新暴露（端粒“脱帽”），导致端粒结构发生破坏。

细胞的遗传增殖是一个相对保守且稳定的过程，其中端粒的存在作用巨大，是细胞染色体的保护者。当POT1的缺失导致端粒结构发生“脱帽”时，由于G-overhang的暴露，使得细胞中的染色体容易发生自重复与四倍体现象，发生遗传紊乱。

1.2 POT1蛋白的缺失导致端粒持续性损伤

端粒是细胞染色体中的重要结构部分，端粒的存在在很大程度上调控了细胞的增殖、凋亡、有丝分裂等必要生命活动，端粒的结构变化将对细胞的生命活动产生巨大的影响。

在Churikov D等人关于POT1生物学功能的研究中[9]，他们通过构建雌激素受体（ER）-POT1蛋白的复合突变株细胞与野生型细胞的对照中发现，在它莫西芬的作用下，两组细胞无表现出明显的区别。而有趣的是，当不受药物它莫西芬干预时，野生型细胞能够保持正常生长，而突变株在前24 h细胞数量几乎无明显变化，而48 h后出现细胞减少的趋势，直到无干预后第三天细胞全部死亡。说明当雌激素受体不受到药物抑制时，能够正常表达，与POT1蛋白结合，导致POT1功能异常。在进一步探究其作用机制的研究中，他们尝试在24 h不干预它莫西芬后，开始加入药物，发现并不能逆转之前的作用损伤，且对ER蛋白与POT1蛋白进行荧光染色发现，两者在突变株细胞中表达均明显下降。说明当POT1下调表达时，导致的端粒结构发生不稳定的过程是不可逆的。

在Kenkichi M等人对于端粒的研究中也发现，当端粒末端结构G-Overhang以自由单链形态暴露出来时，细胞自身将进入DNA损伤状态，大量上调γ-H2AX蛋白表达，致使细胞发生凋亡[10-11]。由于POT1的缺失，使得端粒的结构被破坏而导致的DNA损伤状态被称为端粒的持续性损伤，且这个过程是不可逆的。端粒的持续性损伤导致细胞的有丝分裂无法从G2期过渡至M期，使得细胞周期停滞于G2期，在所有对POT1蛋白的研究中发现，构建的POT1缺失的突变株细胞均出现G2-Arrest状态[9]。

POT1蛋白对端粒结构的完整性与稳定性具有至关重要的作用，并且由于其不可逆的特性，从POT1蛋白表达水平研究靶向端粒结构的抗肿瘤小分子化合物是行之有效的途径[12-14]。

2 以POT1蛋白为靶点的小分子药物的发展

2.1 对端粒抑素的研究的发现推动了靶向POT1蛋白小分子的研究

端粒抑素（Telomestatin）是一种天然存在于人体中的小分子（Figure 2），Dennis Gomez 等人[15]发现该化合物是一种有效的G-四链体的配体，且能靶向结合于端粒3’端悬突结构，导致其结构的退化。后续的研究发现，这样的结构变化导致了POT1蛋白无法与端粒DNA相结合，是诱导细胞有丝分裂异常与凋亡的主要因素。

Figure2 The structure of telomestatin.

端粒抑素作用机制的发现，推动了小分子化合物抗肿瘤的新发展。研究发现，通过靶向作用肿瘤细胞中关键性序列与蛋白，诱导其构象变化，能够引发机体强烈应激反应，从而实现肿瘤细胞的增殖抑制与凋亡。该类机制的发现，使抗肿瘤的研究不再局限于免疫应答与基因手段，大大推动了抗肿瘤研究的进展。

2.2 小分子抗肿瘤化合物的发展

20世纪末，对于聚酰胺的研究热潮以及G-四链体形成机制的研究日渐成熟，使得小分子抗肿瘤化合物突破传统的放疗、化疗以及免疫治疗的垄断，开拓了一片崭新的抗肿瘤研究领域。以下重点介绍以小分子化合物诱导G-四链体的形成，表现高活性抗肿瘤活性。

在对肿瘤发病的机制研究中，发现这是一个复杂的病变过程，无明确的病变起因。对于各肿瘤细胞的普遍研究中，发现肿瘤细胞之所以能够实现永生化，主要是由于在胞内高活性的端粒酶的作用下，以其自身为模板，使端粒得以延伸，导致肿瘤细胞能够无限分裂，所以设计靶向作用于端粒与端粒酶的小分子化合物，能够实现良好的选择性。

2.2.1 以端粒末端及POT1蛋白为靶点的G-四链体构建作用机制

端粒3’悬突是一段富含鸟嘌呤的序列，在正电荷离子中心的共同作用下，具有共轭大平面结构的小分子化合物能够嵌插进入端粒末端中首尾通过氢键相连的鸟嘌呤构成的G-四分体之中，通过π-π堆积作用，诱导G-四链体的形成（Figure 1）。现今，已有报导证实二萘嵌苯、2，7-二取代氨基芴酮、吖啶、乙啡啶衍生物、二取代三嗪，以及最新发现的双角鲨衍生物等具有共轭大平面结构的小分子能够成功诱导端粒DNA形成G-四链体。

端粒末端DNA在小分子化合物的作用下，被诱导形成特殊二级结构-G-四链体，使端粒末端T-环结构与D-环结构受到破坏，将被隐藏的端粒悬突序列重新暴露，使得端粒末端双链结构破坏致使细胞出现端粒持续性损伤。端粒持续性损伤是导致细胞有丝分裂周期出现G2-Arrest，诱导细胞自身凋亡的原因之一，所以以端粒末端为靶点设计能够诱导其形成G-四链体的小分子化合物实现高活性抑制肿瘤增殖是一个行之有效的潜在方法。

Figure3 The structure of compound benzothioxanthene derivatives S1-S6

2.2.2 共轭大平面化合物诱导G-四链体形成机制

在本课题组先前已经报道的研究中[16]，已经证实苯并硫杂蒽类衍生物（Figure 3）能够在细胞外诱导端粒G-四链体的形成，并能有效抑制肿瘤细胞增殖，具有良好的抗肿瘤活性。为探究该类化合物诱导端粒DNA形成G-四链体的机制，用Discovery Studio软件进行计算机分子模拟，以抗肿瘤活性最好的三号化合物（S3）为研究对象，对PDB库中的端粒DNA晶体进行结合模拟。

从结果发现（Figure 4），具有共轭结构的苯并硫杂蒽母环与同为共轭平面的鸟嘌呤与腺嘌呤存在更好的亲和力，易嵌插进入腺嘌呤与G-四分体之间的空间，以化合物：DNA=4∶1，2∶1 的比例为主。小分子配体通过与富G之间以π-π堆积作用力为主，氢键为辅相结合，结合于腺嘌呤与鸟嘌呤之上，诱导端粒DNA向空间结构更紧凑进行，最终形成特殊二级结构-G-四链体。另一方面，化合物中柔性更好的侧链通过空间折叠，嵌入沟槽结构中，通过其上电负性较强的氮原子与沟槽周边碱基形成氢键，使整个结构更为牢固、紧凑。

Figure4 The formation of G-quadruplex by computer molecular simulation.

研究表明，在不含正电荷中心K+共同作用时，具有共轭大平面结构的苯并硫杂蒽类衍生物可以轻易地嵌插进入端粒DNA碱基与碱基之间（以腺嘌呤与鸟嘌呤、胸腺嘧啶与鸟嘌呤之间的空间为主），G-四链体沟槽之间，通过化合物：核酸=4∶1作用比例，强有力地诱导并稳定G-四链体的形成（Figure 4A）。对含有正电荷中心与化合物共同作用，与同一个DNA晶体进行结合模拟发现，结果整个DNA构型发生了有趣的变化，所有相邻碱基之间的空间缩小，整个DNA表现出更紧凑的构型。此时在正电荷中心K+作用下，化合物与DNA更多以2∶1比例相结合，苯并硫杂蒽化合物π电子受到中心K+牵引，嵌入更加完全，使整个G-四链体结构展现更稳定构象（Figure 4B）。

3 结语

对POT1蛋白的研究已较为完善，但却未能有以其为靶点的高效抗肿瘤药物的上市。POT1蛋白的存在与端粒末端的稳定息息相关，对两者的相关研究中，以端粒酶抑制剂为主的抗肿瘤药物占大多数。由于在之前的研究中，对于以POT1蛋白的治疗未能够跳脱出基因手段，导致了其局限性及进入临床的困难。新技术的出现固然是抗肿瘤研究中的重要部分，但新思路的形成也同样重要。研究已久的靶点形成的新作用机制，希望能够一定意义上推动抗肿瘤研究的发展。