白藜芦醇联合SB203580对宫颈癌细胞凋亡迁移的影响及机制

李雪玲，张凯敏,李娈英,李明君

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，位居妇科恶性肿瘤第二位，而病死率位居首位。据统计，我国每年宫颈癌新增病例约30万，死于宫颈癌的约5万，而且宫颈癌的发病率逐年上升并有年轻化的趋势[1-2]。宫颈癌的治疗主要采用手术和放疗，但针对早期病人有很好的效果，对于晚期病人，只能采取放疗，而放疗药物有毒性作用，对病人身体会造成严重危害[3]。因此，寻找低毒高效的抗宫颈癌药物受到广大研究者的关注。中药因作用广谱，且能有效抑制肿瘤增殖，诱导细胞凋亡等作用成为研究热点[4]。白藜芦醇属于非黄酮类多酚化合物，存在于葡萄、藜芦等植物中[5]。研究显示，白藜芦醇对肿瘤的起始、促进、进展三个过程均有明显的抑制作用，并通过多种途径对乳腺癌、肝癌等肿瘤有抑制效应[6-8]。p38丝裂原活性蛋白激酶(p38MAPKs)在多种肿瘤的生长和增殖中处于活性状态，其特异性抑制剂SB203580对子宫内膜癌、食管癌等肿瘤有促凋亡和杀伤特性[9-10]。因此，本研究于2015年3月—2016年3月对白藜芦醇联合SB203580对宫颈癌细胞凋亡迁移的影响及机制进行探索，以期为后续更多研究治疗宫颈癌的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 细胞 人宫颈癌HeLa细胞购自中国科学院细胞库。

1.1.2 试剂 胎牛血清(FBS)(批号：1618862)、RPMI1640培养基(批号：20131112)均购自美国Gibco公司；细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司(批号：B148216)；二喹啉甲酸(BCA)(批号：P0010S-1)、细胞计数试剂盒(CCK8)(批号：1213BS159)均购自碧云天生物技术有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)单克隆抗体购自美国Promeg(批号：101024)；B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2,批号：2772S)、Bcl-2相关X蛋白(Bax,批号：2762S)、单克隆抗体均购自美国CST公司；p38(批号：37619)、p-p38(批号：21771)抗体均购自Abcam公司；HRP标记的羊抗兔IgG(批号：109525)购自北京中杉金桥公司。

1.1.3 仪器 CO2细胞培养箱HERAcell型购自美国Thermo公司；倒置荧光显微镜CK2-TRC-3型购自日本Olympus公司；流式细胞仪LSR II购自美国BD公司；垂直电泳槽DYCZ-24EN购自北京六一仪器；128C型酶标仪购自奥地利CliniBio公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出装有人宫颈癌HeLa细胞的冻存管，37 ℃水浴解冻。向冻存管中加入含有10%FBS、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培养基，1 000 r/min离心5min，倒除上清，加入细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养板中，37 ℃，5%CO2培养箱中培养。观察到细胞融合度达到85%以上时，0.25%的胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞收缩趋于变圆时停止消化，1 000 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，离心，倒掉培养基，加入完全培养基培养，传代。

1.2.2 CCK8检测细胞增殖 取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞，胰酶消化细胞，调整细胞浓度为4×103/mL，将100 μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h。加入40、60、80、100 μmol/L的白藜芦醇作用48 h，对照组不加白藜芦醇。每孔加入含10%CCK8溶剂的培养液100 μL，培养箱中孵育4 h，酶标仪在波长为490 nm处测定并记录各组的吸光度OD，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 白藜芦醇与SB203580对宫颈癌细胞凋亡的影响 将细胞分为四组，即对照组(A组)：不做处理；SB203580组(B组)，加10 μmol/L SB203580；白藜芦醇组(C组)，加60 μmol/L白藜芦醇；白藜芦醇组+SB203580组(D组)，加60 μmol/L白藜芦醇和10 μmol/L SB203580。将生长至对数期的人宫颈癌HeLa细胞以每毫升5×105个细胞接种于96孔细胞培养板中，37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h，观察到细胞融合度达到70%～80%时，加入分组的四组细胞，37 ℃，5%CO2培养箱中培养48 h，收集悬浮及贴壁细胞，1 000 r/min离心5 min，膜联蛋白V-FITC(AnnexinV-FITC)结合液重新悬浮细胞，避光室温孵育10 min，离心，弃上清，碘化丙啶(PI)冰盒中避光孵育10 min。加400 μL缓冲液。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 白藜芦醇与SB203580对宫颈癌细胞迁移的影响 取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞，调整细胞浓度为每毫升105个，Transwell小室上层加入100 μL细胞悬液，下层加入500 μL含10%FBS的RPMI1640培养基，培养24 h后，弃去上下室的培养基，上层分别加入四组细胞，下层加入含10%FBS的培养基，每个浓度设置3个重复孔，37℃，5%CO2浓度培养箱中培养24 h后，将培养基弃去，用棉签轻轻拭掉膜上的细胞，HE染色后随机选择5个视野，显微镜下拍照计数。每组重复3次。

1.2.5 蛋白质印迹法(Western blot)检测p38、p-p38、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达 四组细胞作用于人宫颈癌HeLa细胞48 h后，PBS洗涤细胞，适量的裂解液冰上裂解30 min，收集细胞，4℃ 14 000 r/min离心15 min，收集上清。BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液充分混合，SDS-PAGE电泳分离，4 ℃转膜过夜。取出PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭后，分别以p38、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax作为一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参用自动凝胶成像系统采集图像并计算蛋白表达率。

2 结果

2.1白藜芦醇对细胞增殖的影响为了确定白藜芦醇作用于人宫颈癌HeLa细胞合适的浓度，选择40、60、80、100 μmol/L的白藜芦醇作用于细胞48 h，CCK8检测细胞增殖活性。结果显示，40、60、80、100 μmol/L白藜芦醇的细胞抑制率分别为(24.1±2.3)%、(52.2±3.4)%、(73.1±3.1)%、(91.4±2.7)%，均显著高于对照组(2.2±1.5)%，差异有统计学意义(P<0.05)，且表现出浓度依赖性。60 μmol/L的白藜芦醇抑制了一半的细胞增殖，后续选择60 μmol/L的白藜芦醇作为研究对象。具体数据见表1。

表1 各组的 q′(Dunnett法) 双侧检验结果

注：与对照组相比，aP<0.05

图1 白藜芦醇联合SB203580对宫颈癌细胞凋亡的影响

2.2白藜芦醇联合SB203580对宫颈癌细胞凋亡的影响四组细胞作用于人宫颈癌HeLa细胞48 h后，B组细胞凋亡率显著低于A组，差异有统计学意义(t=10.083，P=0.000)，C组和D组的凋亡率显著高于A组，差异有统计学意义(t1=28.411，P1=0.000；t2=17.700，P2=0.000)，D组显著高于B组,差异有统计学意义(t=7.617，P=0.000)，且低于C组，差异有统计学意义(t=10.710，P=0.000)，如图1和表2。

表2 白藜芦醇联合SB203580对宫颈癌细胞凋亡的影响

注：与A组相比，aP<0.05;与D组相比，bP<0.05

2.3白藜芦醇联合SB203580对凋亡相关蛋白表达的影响四组细胞作用于人宫颈癌HeLa细胞48h后，Western blot检测Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达，结果显示，B组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著低于A组，差异有统计学意义(tCleaved-caspase3=13.276，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=3.345，PBax=0.010)，Bcl-2蛋白表达显著高于A组，差异有统计学意义(tBcl-2=13.203，PBcl-2=0.000)；C组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著高于A组，差异有统计学意义(tCleaved-caspase3=29.791，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=25.948，PBax=0.000)，Bcl-2蛋白表达显著低于A组，差异有统计学意义(tBcl-2=26.217，PBcl-2=0.000)；D组细胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著高于A组，差异有统计学意义(tCleaved-caspase3=19.861，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=12.658，PBax=0.000)，Bcl-2蛋白表达显著低于A组(tBcl-2=18.143，PBcl-2=0.000)，差异有统计学意义(P<0.05)；D组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著高于B组，差异有统计学意义(tCleaved-caspase3=16.514，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=22.603，PBax=0.000)，低于C组tCleaved-caspase3=9.930，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=13.291，PBax=0.000，Bcl-2蛋白表达显著低于B组，差异有统计学意义(tBcl-2=13.013，PBcl-2=0.000)，高于C组，差异有统计学意义(tBcl-2=8.074，PBcl-2=0.000)，如图2和表3。

图2 白藜芦醇联合SB203580对宫颈癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

组别Cleaved-caspase3BaxBcl-2A组0.093±0.0090.154±0.0120.347±0.015B组0.162±0.011ab0.191±0.013ab0.208±0.014abC组0.315±0.013ab0.441±0.015ab0.071±0.010abD组0.223±0.012a0.294±0.014a0.156±0.012aF 值206.872269.831241.618P值0.0000.0000.000

注：与A组相比，aP<0.05；与D组相比，bP<0.05

2.4白藜芦醇与SB203580对宫颈癌细胞迁移的影响四组细胞作用于人宫颈癌HeLa细胞48 h后，B组细胞迁移数显著高于A组，差异有统计学意义(t=9.495，P=0.000)，C组和D组细胞迁移数显著低于A组，差异有统计学意义(t1=24.338，P1=0.000；t2=16.166，P2=0.000)，D组细胞迁移数显著低于B组，差异有统计学意义(t=14.843，P=0.000)，高于C组，差异有统计学意义(t=8.171，P=0.000)，见表4。

表4 白藜芦醇与SB203580对宫颈癌细胞迁移的影响

注：与A组相比，aP<0.05；与D组相比，bP<0.05

2.5白藜芦醇与SB203580对p38和p-p38蛋白表达的影响四组细胞作用于人宫颈癌HeLa细胞48 h后，Western blot检测p38和p-p38蛋白表达，结果显示，B组p-p38蛋白表达显著低于A组，差异有统计学意义(t=5.636，P=0.001)，C组和D组细胞p-p38蛋白表达显著高于A组，差异有统计学意义(t1=11.272，P1=0.000；t2=4.249，P2=0.003)，D组p-p38蛋白表达显著高于B组，差异有统计学意义(t=16.909，P=0.000)，低于C组，差异有统计学意义(t=7.024，P=0.000)，p38在四组的蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3和表5。

图3 白藜芦醇与SB203580对宫颈癌HeLa细胞p38和p-p38蛋白表达的影响

3 讨论

研究显示，白藜芦醇能抑制肿瘤细胞生长并通过杀伤肿瘤细胞达到抗肿瘤的目的，因此被认为是有效的潜在抗肿瘤药物。

表5 白藜芦醇与SB203580对p38和p-p38蛋白表达的影响

注：与A组相比，aP<0.05；与D组相比，bP<0.05

一些体外实验显示白藜芦醇能通过影响细胞生长和炎症、促进细胞凋亡、抗血管转移等途径抑癌和抗癌[11-12]。MAPKs信号通路对细胞增殖、凋亡、肿瘤转移、蛋白合成等途径有调控作用，p38是MAPK信号通路中重要的一员，p38MAPK信号通路能通过调节细胞增殖、凋亡、分化等维持机体各个组织的相对稳定。当p38MAPK信号通路受到抑制时，能引起细胞增殖[13-14]。本研究中用不同浓度的白藜芦醇作用于人宫颈癌HeLa细胞，细胞增殖受到明显的抑制，且随着白藜芦醇浓度增加细胞抑制率增加。60 μmol/L的白藜芦醇抑制了一半的细胞增殖，被选择作为后续研究对象。p38MAPK抑制剂SB203580与白藜芦醇联合处理细胞时，B组细胞凋亡率显著低于A组，C组和D组细胞凋亡率显著高于A组，D组细胞凋亡率显著高于B组，低于C组。这说明白藜芦醇通过p38MAPK抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

凋亡有内源性和外源性两种途径，虽然两种途径的机制不一样，但都需要激活凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3，从而启动细胞的程序性死亡[15]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中，Bax移位到线粒体膜上，导致膜电位发生变化，Bax空间构象变大从而发生活化。Bax发生活化后可诱导线粒体释放细胞色素C，从而诱导细胞的凋亡。Bcl-2和Bax可结合形成二聚体，抑制或促进细胞的凋亡[16-18]。研究显示，Bcl-2表达抑制和Bax表达升高，能使线粒体膜发生渗透性转化，释放细胞色素C，激活Cleaved-caspase3从而诱导细胞凋亡。本研究结果显示，B组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著低于A组，Bcl-2蛋白表达显著高于A组；C组和D组细胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著高于A组，Bcl-2蛋白表达显著低于A组；D组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达显著高于B组，低于C组，Bcl-2蛋白表达显著低于B组，高于C组。

转移是恶性肿瘤的基本特征之一，是对恶性肿瘤不断增殖，并沿着趋化剂浓度梯度向远处转移的过程。其异常生长除了肿瘤本身的生长外，还能向肿瘤临近组织侵袭并转移到其他部位，这往往是肿瘤引起死亡的原因[19-20]。研究显示，白藜芦醇能通过多种机制抑制肿瘤细胞的迁移[21]。本研究结果显示，白藜芦醇能抑制宫颈癌细胞的迁移，p38MAPK抑制剂能减弱白藜芦醇对细胞迁移的影响。这说明白藜芦醇通过调控p38MAPK信号通路抑制宫颈癌细胞迁移。

综上所述，白藜芦醇可通过调控p38MAPK信号通路抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移，并通过调节caspase3、Bax、Bcl-2促进细胞凋亡。