龙眼叶提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

， *，，， ，

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021)

龙眼叶药材是龙眼属龙眼(DimocarpuslonganLour.)的叶或嫩芽。味甘、淡，性平，具有发表清热、利湿解毒之功效，主治感冒发热、疟疾、疔疮、湿疹等[1]。现代药理研究表明龙眼叶具有很好的降血糖作用[2]。我国南方龙眼叶资源蕴藏量丰富，国内外关于龙眼叶降糖作用的研究报道较少。糖尿病是一种由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病[3]。人体血糖主要来源于食物中的糖类和碳水化合物，当过多的食物在体内转换成血糖供人体吸收后，人体就表现为高血糖状态，进而发展成为糖尿病。α-葡萄糖苷酶的作用是阻止食物中的糖类和碳水化合物转化成单糖而被吸收，从而降低血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前用于临床的口服降糖药，能有效地控制餐后血糖[4]，由于其存在胃肠道不良反应，因此，更安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂研究成为热点。本实验对龙眼叶用乙醇提取后，分别用不同溶剂萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，研究其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

infinite M200 PRO酶标仪；LRH-250-S 恒温恒湿培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)；KQ-500DA超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；HWS-24电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)

1.2 试药

龙眼叶药材采自广西贺州市，经广西中医药大学滕建北副教授鉴定为DimocarpuslonganLour.的叶。标本存放于广西中医药大学药物分析教研室。α-葡萄糖苷酶( G5003-100UN Sigma 公司，批号SLBS9070)；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷( PNPG，Sigma 公司，批号BCBR9743V) ；对硝基苯酚(PNP，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170301)；还原型谷胱甘肽(GSH，Sigma 公司，批号213E053)；阿卡波糖( Acarbose，拜耳公司，批号BJ33686) ；二甲基亚砜(DMSO)、无水碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯。

2 方法

2.1 龙眼叶不同提取物的制备

取龙眼叶粉末20g，用10倍量75%乙醇超声提取1.5h，用50%乙醇超声提取1h。冷却，过滤，合并滤液浓缩成乙醇总提取物。加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩萃取液，即得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性研究

将龙眼叶各提取物用DMSO溶解，并储存于4℃冰箱中，以文献[5-6]方法，活性检测在96微孔板上进行，反应体系如下：取pH=6.8的磷酸钾缓冲液50 μL，分别加入GSH 10 μL，样品10 μL，0.57 U/mL α-葡萄糖苷酶5 μL，37 ℃恒温反应15 min，加入浓度为20 mmol/L PNPG 20 μL，37 ℃恒温反应15 min，再加入浓度为0.2 mol/L的NaCO3溶液40 μL，于400 nm波长下测定OD值，每个样品平行测定5次。以阿卡波糖为阳性对照，按下式计算抑制率，并用SPSS22.0软件求出相应IC50值。

酶活性抑制率(%)=[A空白-(A样品-A背景)]/A空白×100

注：A空白:无样品加入反应的吸光值；A样品:加入样品反应的吸光值；A背景:无酶液加入的吸光值。

2.3 标准曲线的绘制

根据采用的反应体系，用磷酸钾缓冲液(pH=6.8)配置1 000 μmol/L PNP，分别稀释成400 μmol/L、300 μmol/L、200 μmol/L、100 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、0 μmol/L。分别取9种不同浓度的PNP溶液各160 μL，加入0.2 mol/L NaCO3溶液80 μL，混匀，在400 nm波长下测定OD值，测3组取平均值。以OD值为纵坐标，PNP浓度为横坐标，做标准曲线。

3 结果

3.1 标准曲线的绘制

PNP标准工作曲线的回归方程为y=0.007 2x+0.098 9，R2=0.999 5，说明PNP在0～1000 μmol/L与OD值呈现良好的线性关系。结果见图1。

图1 PNP标准曲线

3.2 龙眼叶提取物不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

龙眼叶提取物不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响结果表明，5个不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性与浓度呈正量效关系，即剂量依赖性，抑制活性随浓度提高而增强，其中乙酸乙酯提取物的浓度在0.1～1mg/mL范围内呈直线增加，当浓度增加到一定时，浓度只有很小变化。在实验浓度范围内，阿卡波糖的抑制率也随浓度的增加而增加，而龙眼叶乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物在此范围内抑制率均比阳性对照抑制率高。结果见表1、图2。

表1 龙眼叶提取物不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性 (n=5)

图2 龙眼叶不同提取物浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性

3.3 龙眼叶不同提取物的活性比较

由表2可知，在同一浓度下(0.5 mg/mL)，以阿卡波糖为阳性对照，α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，龙眼叶乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物抑制率分别达到68.69 %(IC50=0.105 2 mg/mL)、66.85 %(IC50=0.126 1 mg/mL)，均高于阳性对照药阿卡波糖的63.57 %(IC50=0.196 0 mg/mL)。龙眼叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性从大到小依次为：乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>阿卡波糖>乙醇总提取物>石油醚提取物>水提取物。结果见表2、图3。

表2 龙眼叶不同提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性 (n=5)

图3 不同提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性比较

4 讨论

本实验在体外实验的基础上，首次发现龙眼叶乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，龙眼叶乙酸乙酯提取物抑制率为为68.69%，正丁醇提取物抑制率66.85%，两个部位的提取物抑制率都比阿卡波糖(63.57%)高。实验还探讨了不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响，结果表明，在一定范围内，抑制活性与浓度呈正相关，即随着浓度的增高，抑制活性也不断增强，但随着浓度超过一定范围，抑制率仅有很小程度的变化，说明浓度越高，抑制活性并非一直增强。实验结果表明龙眼叶乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均通过抑制α-葡萄糖苷酶而实现降血糖作用。