益生菌与肠道TLR2和TLR4表达相关研究进展

2019-02-14段玲，周毅

饲料博览 2019年1期

段玲，周毅

（1.渠县畜牧技术推广站，四川达州 635200；2.四川农业大学，成都 611130）

天然免疫应答是机体抵御微生物感染的第一道屏障，在动物肠道内微生物数量多达1 014种，肠道微生物被称之为动物体最大的“免疫器官”[1]。在整个过程中Toll样受体家族蛋白（TLRs）具有重要的作用[2-3]。TLRs通过识别肠道内容物中各种异物分子启动信号传递过程。这些异物分子可能是病原微生物，也可能是其他蛋白，主要来自肠道中各种微生物或者食源性物质，结构通常是高度保守的和非特异性的病原体相关分子模式（PAMPs）。TLRs完成胞外信号向胞内转导后，启动宿主多种细胞产生各种细胞因子，通过一系列炎症反应抵抗微生物的侵袭[1]。肠道微生态平衡对宿主健康有着密切的联系，一个平衡的微生态在调节机体免疫、协同宿主代谢等方面具有重要的作用。益生菌通过黏附作用阻断致病菌的入侵，提供适当的配体和刺激因子影响免疫系统及肠道组织的发育，通过代谢产生挥发性脂肪酸、氨基酸等为宿主提供能量，通过多种多样的信号传导方式调节宿主免疫力[4-8]。

益生菌发挥功能是多途径、多方面的。益生菌通过自身的各种代谢产物调控肠道菌群，达到抑制有害微生物生长，促进有益微生物定植。益生菌还可通过与宿主各个功能细胞相互作用，达到调控宿主生长、代谢和免疫等过程。在宿主识别胞外信号途径中，包括TLRs在内的各个受体发挥着十分关键的作用。TLRs作为益生菌发挥功能过程中重要的一个方面，其变化对宿主健康状态有着十分重要的影响。所以研究益生菌与肠道TLR2和TLR4之间的关系意义重大。

1 益生菌概述

益生菌简单来说就是有益的活性微生物，具体是指一类对宿主具有有益功能的活的微生物，其定植于宿主肠道、口腔、生殖系统及皮肤表面，能够产生一定的有益功效，包括改善宿主微生态平衡、抑制害细菌增殖、协助宿主代谢营养物质、调控宿主免疫系统等功能[9]。因此，益生菌在维持宿主健康状态，疾病防治等方面发挥着十分重要的作用[10-11]。乳酸杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）以及部分芽孢杆菌（Bacillus）芽孢杆菌是目前公认的益生菌菌属。其通过自身或者分泌酶类协同宿主消化，代谢产物有的可以直接所谓宿主营养和能量来源（挥发性脂肪酸，维生素等），通过抑制病原微生物，促进黏膜修复，参与细胞免疫应答等途径促进宿主健康。特别是在维持机体肠黏膜屏障功能的完整性方面起重要作用，能够通过刺激免疫细胞，参与免疫调控过程，并且能够增强消化道防御屏障，发挥抗炎症、抗感染的作用[12]。

2 Toll样受体的发现

TLRs是Lemaitre在研究果蝇胚胎发育时发现的一种跨膜蛋白受体，进一步研究表明，该受体具有细胞信号转导功能，在感染和免疫应答过程中具有关键作用[13]。1997年Janeway等首次发现与Lemaitre发现的果蝇Toll样受体同源蛋白受体，并将其命名为Toll样受体4（TLR4）[14]。此后，其他的Toll样受体被陆续被发现，目前在哺乳动物中已有12个Toll样受体家族成员被发现。Toll样受体在进化上十分保守，从线虫到哺乳动物体内均有表达，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10主要分布在细胞表面，其主要识别微生物表面膜上的组分，包括脂多糖、磷壁酸、鞭毛蛋白等；而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在细胞质中表达，主要识别微生物核酸[15-17]。

3 Toll样受体蛋白结构

TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白，整个胞外区呈马蹄形结构，在胞外区结构中富含亮氨酸重复序列（LRR）每个重复序列由24～29个氨基酸组成，能够特异性的识别PAMPs[18-19]。TLRs跨膜蛋白胞内区域与IL-1 Receptor（IL-1R）家族成员高度同源，因此该区称为Toll-IL-1受体结构域。TIR结构域含有多个高度保守区域其主要是在细胞信号转导过程中发挥作用，TIR总共有5种衔接蛋白，包括MyD88、TIR结构域衔接蛋白、诱导IFN-β的TIR结构域衔接蛋白、TRIF相关衔接蛋白和含sterilea与HEAT-Arma dillo的衔接蛋白。TLRs在识别PAMPs过程中，可以利用不同的转导衔接蛋白，目前已经确定TLR4可以使用所有的衔接蛋白进行信号转导[20]。

4 TLR-2和TLR-4对应的配体

在TLRs家族中，能够广泛识别多种配体，其主要来源于各种病原微生物的组成成分，即病原相关分子模式PAMPs，如脂多糖（LPS）、肽聚糖、胞壁酸、多种细菌和病毒核酸等[21]。目前，因为TLR2和TLR4能够广泛识来源于细菌的各种PAMPs，其相关识别和信号转导过程研究比较深入。TLR2与配体结合通过信号转导促进肿瘤坏死因子α生成，但是这一过程又会受到TLR6的抑制。TLR2在识别阿拉伯甘露糖、脂蛋白等配体时只有和TLR1或TLR6形成异二聚体才能完成信号转导过程，而产生的细胞因子反过来会促使TLR2具有更广泛的识别PAMPs能力[22]。

TLR4可以识别革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖（LPS）和坏死细胞释放的热休克蛋白（HSP）。肠道中致病性大肠杆菌宿主（革兰氏阴性菌）或通过其他途径入侵到血液中时，TLR4将会被激活并识别LPS，LPS不是直接和TLR4结合而是首先与LPS结合蛋白（LBP）形成复合物。随后，LPSLBP复合物与CD14相互作用后再与细胞表面的TLR4结合，将微生物入侵信号导入胞内。因此，此途径由LPS、LBP和CD14共同完成TLR4信号转导过程[23]。除此之外，TLR4还需要髓样分化蛋白2（MD-2）才能被激活，只有当位于细胞膜上的MD-2与TLR4胞外区连接时，TLR4才能启动识别LPS复合物[24]。

5 TLR2和TLR4的分布

Takeda等证实，TLRs广泛分布于动物的各个组织和器官中，但其表达水平各不相同。动物肝、脾、肺、心、肾、脑及胸腺中均有表达，而TLR2、TLR4只在髓源性细胞中表达，如单核巨噬细胞[25]。TLR4分布广泛，如心肌细胞和微血管内皮细胞、气道上皮细胞、肺巨噬细胞、腹膜巨噬细胞、库普弗细胞、脂肪细胞和肠上皮细胞；TLR2分布在细胞表面，如成纤维细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞[26]。聂奎等采用荧光定量的方法研究日本大耳白兔时发现TLR2和TLR4在十二指肠、盲肠、胸腺、脾脏等15个不同组织部位均检测到TLR2和TLR4，但在骨细胞中未检测到表达[27]。

6 益生菌与TLR2、TLR4表达

6.1 乳酸杆菌与TLR2、TLR4表达

乳酸杆菌作为一种十分重要的益生菌，其自身代谢产物能够抑制病原微生物生长。同时，其还可以通过竞争抢占肠黏膜位点，进一步抑制有害微生物的生长[28-29]。Lactobacillus plantarum NDC 75017与Caco-2细胞共培养能够通过TLR2途径激活NF-κB信号通路，诱导产生细胞因子达到增强机体免疫作用[30]。Lee等在研究乳酸菌对结肠炎的治疗效果时发现，乳酸杆菌可以降低TLR4的表达，降低肠道炎症反应[31]。研究三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎模型时，大鼠出现结肠变短，细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显著增加。但是给予结肠炎模型大鼠Lactobacillus suntoryeus HY7801干预后，结肠中NF-κB和TLR4表达受到抑制，细胞因子IL-β、IL-6、TNF-α的表达量均出现明显下调。张琳等使用抗生素构建腹泻大鼠模型，发现腹泻发生早期大鼠肠黏膜、脾脏、肝脏中TLR2和TLR4表达显著降低，肠道微生态系统发生紊乱并导致菌群向其他组织易位，而乳酸杆菌的干预治疗可以降低TLR2和TLR4 mRNA转录抑制情况的同时减轻细菌易位的程度[32]。反之，给腹泻小鼠使用大肠杆菌，TLR2和TLR4基因表达量显著上调，细菌易位程度则会加剧。Lactobacillus casei CRL 431（副干酪乳杆菌CRL431）在保护宿主免受沙门氏菌入侵时，在感染沙门前和感染后补充Lactobacillus casei CRL 431发现TLR2和TLR4表达均上调，感染后停止口服副干酪乳杆菌CRL431也出现表达上调，然而10 d后这两组TLRs基因表达水平均与对照组相似[33]。由此可见，乳酸杆菌在调节肠道微生态平衡，维持宿主肠道健康方面扮演着十分重要的角色，当肠道微生态失调时TLR2和TLR4表达受到影响，乳酸杆菌干预后肠道微生态朝着有利于宿主健康方向发展，TLR2和TLR4表达相应的也恢复到平衡状态。因此乳酸菌能够使TLRs表达、肠道菌群平衡及宿主健康三者之间处于最佳平衡状态。

6.2 双歧杆菌与TLR2、TLR4表达

双歧杆菌有着“长寿菌”之称，是一种重要的益生菌，目前市售的大多数益生菌饮品及其他产品，都添加了不同菌株的双歧杆菌。双歧杆菌参与了宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染过程。双歧杆菌的免疫调节功能尤为突出，尤其在维持机体肠黏膜屏障的完整性方面起重要作用，能够通过免疫调节、免疫排斥和免疫清除，加强消化道防御屏障，发挥抗炎症、抗感染的作用[12]。周国华等在研究双歧杆菌对大鼠末端回肠炎的影响时，发现无论高低剂量都可以引起TLR2和TLR4表达量的下降，从而降低末端回肠炎症的炎症反应[34]。王海昆等研究也发现这一现象，非酒精性脂肪肝家兔肠道内大肠杆菌数量与肠黏膜TLR4表达呈正相关性，而双歧杆菌数量与肠黏膜TLR4表达量呈负相关[35]。研究显示，给仔猪给予不同剂量的双歧杆菌后其肠肠道细胞中TLR2表达上调，Khailova以IEC-6（Intestinal Epithelial Cells 6）为模型，在细胞培养液中添加TNF-α和IFN-γ模拟NEC，发现无论是否添加TNF-α或IFN-γ只要与双歧杆菌共培养在荧光显微镜下就能观察到TLR2的表达，COX-2的表达也随之增加[36]。而其他未添加双歧杆菌组则不能观察到TLR2的表达。这说明TLR2能够识别革兰氏阳性菌，也说明双歧杆菌能够激活TLR2传递相关信息促进COX-2表达，进一步参与炎症反应。由此可见，双歧杆菌可以通过与TLRs（主要是TLR2）的相互作用，调动宿主免疫反应为防止病原微生物的入侵，并且利用自身的益生作用维持宿主健康状态发挥这巨大作用。

6.3 其他益生菌与TLR2、TLR4表达

研究显示，大肠埃希菌益生菌株Nissle 1917可通过TLR2和TLR4依赖的途径改善葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎，丁酸梭菌则可以通过激活TLR2调节的骨髓分化因子88（MyD88）的非依赖性途径，引起NF-κB、IL-8、IL-6及TNF-α的分泌，以抵抗病原菌的感染同时防止自身免疫紊乱[37-38]。给断奶仔猪分别灌胃益生菌不拉氏酵母和枯草芽孢杆菌B10，益生菌组肠道发育状况优于对照组，TLR2、TLR4相关信号蛋白以及信号末端相关细胞因子都出现明显上调[39]。