miR-126对男性喉癌患者进展影响的生物信息学分析

魏梅，王晓雨，杜建群，林鹏

喉癌是一类常见恶性肿瘤［1］，探究喉癌发生发展的机制，积极诊治对保留喉发声及其他功能具有重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是真核细胞中一类非编码小RNA，可通过调控多个靶基因影响胚胎发育［2］及肿瘤［3］等疾病进展。目前，虽有miR-126影响胃癌［4］、肺癌［5］等肿瘤进程的报道，但鲜见其对喉癌影响的综合研究。本文通过对肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的分析，系统了解miR-126通过哪些靶基因影响男性喉癌患者的进展，并对靶基因基因本体论和参与的信号通路进行分析，旨在为喉癌的治疗提供新的靶点和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料 喉癌患者相关TCGA数据（更新时间2017年11月27日）由UCSC Xena（https://xenabrowser.net/datapages/）下载，根据性别、年龄、总生存率（overall survival，OS）、肿瘤分级、临床分期以及miRNA和mRNA表达量数据的完整性筛选得到97例男性喉癌患者数据。根据TCGA编号末尾数发现其中10例患者不仅具有肿瘤组织表达量，同时具有癌旁miR-126表达数据，将数据整理为10对患者miR-126癌与癌旁配对表达数据。

1.2 分组 根据miR-126表达水平的平均值将患者分为低表达和高表达组；根据年龄平均值分为低龄组和高龄组；肿瘤分级G1和G2为低分级组，G3和G4为高分级组；临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期为低级别组，Ⅳ期为高级别组。

1.3 miR-126有效靶基因的分析 通过检索miRWalk 2.0数据库（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）得到已验证的与miR-126相互作用的靶基因，并在TCGA数据库中找出相应靶基因mRNA表达量值，根据各组基因表达量的平均值将其分为相应基因的低表达量组和高表达量组，若Kaplan-Meier（K-M）法分析发现其表达量与喉癌患者总生存率有关，则认为该基因是miR-126影响男性喉癌生存的有效靶基因。

1.4 富集分析方法 将有效靶基因作为gene list提交到DAVID预测分析网站（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），其余参数均选择默认，转换成相应的基因号提交分析系统，选择物种为“Homo sapiens”，对有效靶基因进行基因本体（GO）注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路进行富集分析。

1.5 统计学方法 用IBM SPSS Statistics 19.0、GraphPad Prism 7、Excel 2013对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料数据采用均数±标准差（xˉ±s）表示；采用K-M法分析相应基因表达量与OS间的关系；男性喉癌患者预后影响因素分析采用Cox比例风险模型；配对的癌与癌旁miR-126表达量差异分析采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌患者数据基本信息 97例男性喉癌患者年龄38～83岁，平均（62.2±9.0）岁，以年龄平均数62.2岁为界限分为低年龄组（≤62.2岁，51例）和高年龄组（＞62.2岁，51例）；miR-126平均表达量为10.964±0.906，以平均值为界限分为低表达（49例）和高表达组（48例）；肿瘤低分级组有62例，高分级组有31例，4例分级不确定；临床分期低级别组33例，高级别组60例，4例未确定分级。

2.2 miR-126是男性喉癌患者预后的独立影响因素 K-M法分析发现，miR-126对男性喉癌患者总生存率影响明显（P=0.001），高表达组的预后明显优于低表达组，miR-126高表达有利于延长男性喉癌患者的生存时间（图1）。联合考虑患者的年龄、肿瘤分级、临床分级以及miR-126表达量，进行多因素Cox比例风险模型分析。结果显示，miR-126是男性喉癌患者预后的独立影响因素，见表1。

Fig.1 KM plot of miR-126 expression and overall survival rate in patients with laryngeal cancer图1 喉癌患者miR-126表达量与总生存率间关系函数图

Tab.1 Multivariate Cox proportional hazard analysis of patients with laryngeal cancer表1 喉癌患者多因素Cox回归分析

具有癌与癌旁miR-126表达量的10例患者中，miR-126在癌组织的平均表达量为10.170±0.811，而在癌旁正常组织的平均表达量为11.059±0.612，miR-126在肿瘤中的表达量低于癌旁正常组织（t=3.098，P=0.013），这进一步说明miR-126能够抑制肿瘤的发展。

2.3 miR-126靶基因的预测 通过miRWalk2.0数据库检索miR-126的靶基因，发现该miRNA有L2HGDH、GRIN2B、NFKBIA、KRAS、SIRT1、CRK等58个靶基因，这些靶基因已在一种或多种实验方法中得到验证，这些实验方法包括紫外交联免疫沉淀结合高通量测序、报告基因检测、免疫组化、逆转录PCR、蛋白印迹检测等。见表2。

2.4 miR-126靶基因在喉癌患者中的表达差异分析 通过K-M法分析发现，58个靶基因中7个基因的不同表达水平对喉癌患者的生存具有一定的影响（P＜ 0.05），这7个有效靶基因为DNMT1、GRIN2B、L2HGDH、PIK3R2、PTPN7、SIRT1、TWF1。TWF1基因低表达患者生存期较长，而其他基因高表达者生存期较长，见图2。

Tab.2 The information of miR-126 target genes表2 miR-126靶基因信息

2.5 miR-126有效靶基因GO注释分析 GO注释分析结果显示，靶基因DNMT1、SIRT1参与了异染色质的组成，异染色质的出现往往会降低基因的转录活性，miR-126可以通过参与基因结构的调控影响细胞活动。分子功能方面，靶基因对催化反应和转移酶的激活具有影响。50%以上的有效靶基因参与的生物学过程达到了9个，其中所有有效靶基因均参与的过程为细胞大分子的代谢过程，细胞代谢产生的能量及小分子物质对细胞的正常生长及病变均有重要的作用。另外一大部分有效靶基因还参与大分子修饰、磷酸化调控等过程。见表3。因此miR-126既能通过影响喉癌细胞中染色体的转录活性，也可通过调控癌细胞中能量的代谢过程来影响喉癌患者的病程。

2.6 miR-126有效靶基因KEGG通路分析 有效靶基因KEGG通路富集结果显示，GRIN2B和SIRT1参与了Amphetamine addiction通路，对其药物的代谢存在影响。PIK3R2、SIRT1参与了AMPK信号通路和FoxO信号通路。AMPK通路作为一个能量代谢调节的关键通路，影响整个细胞的生命活动，能量代谢的失控可能会导致肿瘤的发生发展，FoxO信号通路的改变会导致细胞凋亡、细胞周期调控、葡萄糖代谢等过程失控。

3 讨论

Fig.2 KM plot of effective target gene expression and overall survival rate in patients with laryngeal cancer图2 喉癌患者有效靶基因不同表达量患者的总生存曲线图

miRNA作为一种重要的转录后修饰方式，对基因的表达具有重要的作用，因此探究miRNA调控肿瘤的研究越来越多，miRNA通常会调控多种靶基因的表达，靶基因综合作用的结果导致其对肿瘤的影响，然而大量研究往往只针对miRNA的一个或一类靶基因，因此综合分析所有靶基因对研究miRNA的作用具有重要意义。

3.1 miR-126高表达利于延长男性喉癌患者生存时间 本研究显示，miR-126高表达男性喉癌患者总生存率明显提高，且在癌旁的正常组织中的表达量明显高于癌组织，与在前列腺癌［6］和肺癌［7］中的研究结果一致。本文首次通过TCGA数据库数据对miR-126对男性喉癌的影响展开研究，为进一步研究提供了数据支持。

3.2 miR-126通过7个靶基因影响男性喉癌的进展 虽然已有文献对miR-126的所有靶基因及其在人体正常器官中的功能进行过分析［8］，但它在喉癌中的作用尚鲜见研究。本文通过对靶基因对男性喉癌患者生存影响的分析，发现58个靶基因中有7个基因对男性喉癌患者的生存有重要的影响。7个基因中DNMT1［9］和SIRT1［10］已在喉癌研究中报道，其他5个基因是我们通过数据分析后新发现的影响男性喉癌患者生存的因素，这为在分子机制方面研究喉癌进展提供了新的思路。

3.3 有效靶基因功能分析 通过对有效靶基因的分析可以深入了解靶基因在细胞中的作用，为分析miR-126对肿瘤患者的影响提供更多的研究方向。GO富集从参与的生物学过程、细胞组分及分子功能方面分析发现有效靶基因DNMT1、SIRT1可以通过参与异染色质的出现，进而对相应基因的表达进行调控来影响肿瘤发展［11］。分子功能方面，大部分有效靶基因对催化反应和转移酶的激活具有影响。细胞代谢、大分子修饰等9个生物学过程参与的有效靶基因达到一半以上，其中所有有效靶基因均参与了细胞大分子的代谢过程，细胞能量代谢的异常以及中间产物非正常的积累往往会导致细胞分化增殖的失调，进而会引发肿瘤的发生［12-13］。另外，大分子修饰、磷酸化等过程也会影响肿瘤进程。KEGG通路富集分析发现，PIK3R2、SIRT1参与的AMPK信号通路和FoxO信号通路正是能量代谢与细胞凋亡相关的信号通路［14］，AMPK是FoxO信号通路上游的重要分子［15］，两者共同作用可以调控细胞周期、凋亡等过程，进而会影响肿瘤的发生发展。

Tab.3 GO enrichment analysis of miR-126 effective target gene表3 miR-126有效靶基因的GO富集分析

Tab.4 Signal pathway enrichment analysis of miR-126 target gene表4 MiR-126靶基因信号通路富集分析

综上，本研究分析发现，miR-126通过DNMT1、GRIN2B、L2HGDH、PIK3R2、PTPN7、SIRT1、TWF1这7个靶基因调节代谢和细胞凋亡等过程，进而延长男性喉癌患者的总生存率，通过本文的分析，可以使我们通过能量代谢途径分析研究miR-126与男性喉癌进展的关系，为进一步研究提供了理论支持。