内质网应激介导的自噬与凋亡及其信号网络间相互作用的研究进展

赵雪聪，陈乃耀

(华北理工大学附属医院，河北唐山063000)

内质网是由生物膜组成的、互相通连的片层隙状或小管状系统，是蛋白质合成与折叠、维持Ca2+动态平衡及脂类代谢的主要场所[1]。任何引起蛋白分泌负荷增加的因素及病理状态下突变蛋白的存在，均可导致细胞质中出现错误折叠或未折叠蛋白的蓄积，这种状态被称为内质网应激[2]。为了应对内质网应激，恢复细胞内稳态，细胞会通过未折叠蛋白反应、自噬等提升蛋白正确折叠能力并加快非功能性蛋白降解。未折叠蛋白反应是感知和应对内质网应激的首要环节，也是诱发自噬和凋亡的重要因素。自噬是一种利用溶酶体水解酶降解蛋白和其他多种细胞成分的批量降解系统，各种生理性应激或病理改变引起的内质网应激和未折叠蛋白反应，可导致自噬的补偿性激活，从而维持蛋白质稳态[3]。内质网应激后的自噬具有抑制凋亡相关蛋白激活、促进细胞存活的功能。但当内质网应激过强或持续时间过长，可诱导自噬瞬时上调，激活细胞凋亡途径[4]。同时，凋亡相关蛋白的激活也可对自噬产生抑制作用，促进细胞死亡。由此可见，内质网应激介导的自噬具有抗凋亡和促凋亡双重作用。自噬与凋亡相互作用、相互调节，协同调节细胞的生存或死亡。因此，阐明内质网应激后未折叠蛋白反应信号通路的调节机制，认识细胞自噬与凋亡的相互串扰作用，对保证细胞正确的生死决策具有重要意义。本文结合文献就内质网应激介导的自噬与凋亡及其信号网络间的相互作用作一综述。

1 内质网应激与未折叠蛋白反应的关系

内质网应激是细胞的一种保护性机制，表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集及钙离子平衡紊乱。内质网应激可激活未折叠蛋白反应，通过一系列反应，如关闭蛋白质翻译以减少新合成的蛋白质负荷、诱导促进蛋白折叠的内质网伴侣转录翻译、激活错误折叠或未折叠蛋白的泛素化和蛋白酶体降解等[5]，缓解内质网应激，恢复内质网稳态。研究表明，介导内质网应激的通路有3条，这3条通路的起始蛋白分别为肌醇需求激酶1(IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子6(ATF6)[6]。在生理状态下，IRE1、PERK、ATF6与分子伴侣GRP78/BIP结合形成稳定复合物，处于未激活状态。当内质网中蓄积大量错误折叠或未折叠蛋白时，IRE1、PERK、ATF6与GRP78/BIP解离，并激活未折叠蛋白反应信号级联。其中，IRE1、ATF6激活能促进未折叠蛋白反应靶基因的转录，如伴侣、折叠酶和内质网相关降解通路成分的表达；PERK激活则可导致蛋白翻译的普遍抑制[7]。

PERK与GRP78解离后会自体磷酸化和低聚化，活化真核起始因子2α(elF2α)，能够降低蛋白质合成并减少进入内质网的蛋白量[8]。IRE1与GRP78解离后会触发IRE1寡聚化以促进激酶结构域发生自身磷酸化，导致邻近内切酶(RNase)的变构激活，然后从编码XBP1的转录因子中删除一个26 nt的内含子，产生XBP1的剪接异构体(XBP1s)，而XBP1s可上调伴侣蛋白、折叠酶等蛋白表达，从而缓解内质网应激，恢复内质网稳态[9]。ATF6是一种内质网应激调节时的跨膜转录因子，包括α、β两种亚型，均为Ⅱ型跨膜蛋白。在内质网应激状态下，ATF6α/β被转运至高尔基体，由S1P和S2P两种蛋白酶顺序切割，将其胞质结构域从膜区释放出来。被切割的ATF6α转移至细胞核内，驱动编码内质网应激蛋白的基因转录，如GRP78、ERp72、Ca2+-ATP酶等，同时启动内质网相关降解机制，恢复内质网稳态[10]。

2 内质网应激介导自噬发生

自噬是真核细胞利用溶酶体清除自身异常蛋白和受损细胞器的病理生理过程，是维持细胞稳态的一种重要机制，根据降解途径不同分为大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种。它们虽然在机制上有所不同，但均与溶酶体降解有关。通常所说的自噬即为大自噬，也是目前研究最多的一种自噬[11]。自噬通过双层膜结构包裹需要降解的蛋白质、细胞器等成分形成自噬体，然后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，继而对自噬体内部成分进行降解。整个自噬过程由一系列被定义为自噬相关基因(ATG)编码的蛋白质所调控。

在哺乳动物细胞中，自噬的起始过程主要由ULK1复合物参与诱导，此复合物由ULK1、ATG13、FIP200、ATG101组成。在吞噬泡的形成、成熟过程中需要磷脂酰肌醇3-激酶与Beclin-1复合物的调控。ATG12和ATG8/LC3的泛素共轭系统则维持吞噬泡的扩展[12]。研究表明，LC3和GABARAP家族蛋白不但能通过参与吞噬泡形成、伸长和闭合，促进自噬体和溶酶体融合，还能通过与自噬适配体蛋白的相互作用，在吞噬多种特定底物方面具有关键作用[13]。尽管内质网应激下未折叠蛋白反应对自噬的调控机制尚不完全清楚。但已有研究证实，内质网应激可通过未折叠蛋白反应导致自噬的激活。介导内质网应激3条通路的起始蛋白IRE1、PERK、ATF6在加工、诱导、囊泡成核和伸长等阶段调节自噬。

内质网中未折叠蛋白的蓄积能促进内质网膜IRE1寡聚化和胞质结构域的自身磷酸化，然后与肿瘤坏死因子受体相关因子2和凋亡信号调节激酶1结合形成复合物，导致Jun-N-末端激酶(JNK)下游激活，从而促进自噬。JNK介导的Bcl-2磷酸化可导致Beclin-1/Bcl-2复合物断裂，释放Beclin-1，进而形成Vps34-Beclin-1复合物，驱动分离膜的成核[14]。此外，由IRE1 RNase结构域介导的XBP1也可通过转录激活Beclin-1触发自噬。

PERK在寡聚化和自身磷酸化作用下能够磷酸化elF2α，而elF2α磷酸化能够使ATF4表达增加。研究表明，elF2α-ATF4通路可参与内质网应激诱导的自噬激活[15]。ATF4转录调控Atg12，ATF4介导的C/EBP同源蛋白(CHOP)活化诱导Atg5。Atg5、Atg12和Atg16L形成Atg5-Atg12-Atg16L复合物，能够调控自噬伸长过程[16]。

内质网应激下转运至高尔基体的ATF6，可被S1P和S2P切割。被切下的ATF6 N端胞质结构域进入细胞核，与ATF/cAMP反应元件SANO和内质网应激反应元件结合，激活靶基因，如XBP1、CHOP[17，18]。ATF6则通过XBP1、CHOP间接调节自噬。

此外，内质网中Ca2+含量较高，能够调控细胞内Ca2+稳态。内质网应激状态下，Ca2+从内质网向胞质释放增多，通过从IP3R释放的Ca2+激活CaMKK/AMPK依赖途径，解除了mTOR对ULK1复合物的抑制，在诱导自噬过程中具有重要作用[19]。Ca2+释放激活的死亡相关蛋白激酶参与Beclin-1的磷酸化，并促进Beclin-1从Bcl-2解离，从而诱导自噬[20]。

总之，内质网应激介导的自噬机制非常复杂，涉及多条信号通路，这些信号通路能够在不同阶段调节自噬过程。

3 内质网应激诱导细胞凋亡

内质网应激发生时，未折叠蛋白反应的3条信号通路通过介导自噬来提高蛋白折叠能力，去除错误折叠和未折叠蛋白。如果内质网应激程度过强或持续时间过长，补救措施不足以恢复应激情况下的内质网稳态，则未折叠蛋白反应将通过由CHOP、JNK和Caspase-12介导的信号通路触发细胞凋亡。目前，CHOP介导的信号通路研究最广泛。

慢性内质网应激时，CHOP激活可直接或间接通过多种途径介导促凋亡信号。CHOP通过抑制Bcl-2及上调BIM、PUMA表达触发固有的凋亡途径，后者能调节BAX-BAK介导的线粒体外膜通透性，这将导致细胞色素C释放和Caspase级联反应。CHOP还通过FADD和Caspase-8介导的级联反应直接诱导DR5介导的外源性凋亡途径[21]。在正常情况下，CHOP诱导的ERO1α可氧化PDI产生活性氧，其在细胞凋亡中具有关键作用[22]。除活性氧外，ERO1α-IP3R-Ca2+-CaMKII通路也可触发多种凋亡途径，主要通过PTP的Ca2+依赖性线粒体凋亡[23]。CHOP可通过促进GADD45表达，完全阻断蛋白质的合成而触发细胞凋亡[24]。CHOP-ATF4可协同激活TRB3的转录活性，促进CHOP诱导的多种细胞凋亡，如心肌细胞[25]，TRB3则通过直接与AKT结合而抑制其磷酸化，从而发挥促凋亡作用。此外，CHOP下游的ATF5通过激活一些促凋亡基因也能促进细胞凋亡。

4 内质网应激介导的自噬与凋亡的相互作用

越来越多研究证实，自噬与凋亡并不是独立的，它们在不同层次上的相互连接，产生了串扰作用，使它们的调控网络更加复杂[26]。研究发现，自噬的激活通过降解错误折叠或未折叠蛋白和受损的细胞器，抑制Caspase-8的激活，通过消除SQSTM1/p62来抑制细胞凋亡，而SQSTM1/p62在内质网应激下具有保护作用。细胞凋亡通常伴随着高水平的Caspase活化，尤其是Caspase-8、Caspase-3和钙蛋白酶的激活，可导致自噬蛋白的裂解，使自噬程序失活，终止细胞保护作用，加速细胞死亡[27]。虽然自噬作用有利于细胞生存，但凋亡启动仍会导致细胞死亡。因此，这种串扰作用在细胞对各种刺激信号(如内质网应激、营养剥夺)的平衡反应中具有至关重要的作用。

自噬和凋亡通常发生在同一细胞中，自噬先于凋亡[28]。这是因为内质网应激通常会诱导自噬反应，特别是当内质网应激水平不足以导致细胞死亡时，而当内质网应激超过临界持续时间或强度阈值时，凋亡和非凋亡致死程序被激活[29]。Holczer等[30]观察了不同内质网应激作用下自噬依赖存活和凋亡杀伤机制的激活动力学，结果发现低水平的内质网应激往往会导致自噬，但在较高的内质网应激时自噬被瞬时激活，然后伴随细胞凋亡激活，与此同时，自噬被迅速抑制。这表明当内质网应激水平超过阈值时，自我杀伤机制会以一种类似开关的方式被激活，而细胞开始凋亡时自噬可能被灭活，其原因可能与Caspase介导的自噬蛋白断裂有关。此外，在特定情况下，自噬或参与自噬过程的蛋白质可能通过分解细胞不可或缺的组分，或推进凋亡与坏死程序的激活而促进细胞死亡[31]。

众所周知，衣霉素可诱导内质网应激，表现为伴侣蛋白GRP78、GRP94表达增加，以及elF2α磷酸化增强。Lei等[24]研究发现，衣霉素诱导的内质网应激可同时导致细胞凋亡和自噬，自噬抑制剂3-MA预处理或直接敲除LC3B可促进肝癌细胞凋亡，而自噬激活剂雷帕霉素预处理则能抑制衣霉素诱导的肝癌细胞凋亡。结果表明，自噬的激活可在一定程度上保护肝癌细胞免受内质网应激所致的损伤。另外，衣霉素还能明显上调肝癌细胞CHOP表达，而CHOP特异性敲除不仅能增强自噬，还能显著降低肝癌细胞凋亡。因此，CHOP可通过抑制体外自噬作用而促进内质网应激诱导的肝癌细胞凋亡。

有研究表明，未折叠蛋白反应中的IRE1和PERK通路在调控内质网应激诱导的自噬-凋亡串扰中具有重要作用。IRE1和PERK通路可介导多种自噬基因的转录上调，如p62、NBR1、NIX等，抑制IRE1或PERK可使这些自噬基因在内质网应激中的表达消失[32]。提示在内质网应激下，自噬途径中主要参与的编码基因发生了大规模的转录级联反应。然而，在持续的内质网应激下，许多促凋亡事件开始主导并导致细胞凋亡。激活的IRE1能够招募TRAF2，导致下游JNK活化及PERK激活，诱导CHOP调控凋亡相关基因转录，继而导致线粒体外膜的通透性增加并启动内在的凋亡程序。有研究发现，IRE1和PERK通路并不是彼此独立的，它们之间存在着密切联系。Márton等[8]研究发现，在内质网应激期间，PERK沉默会提高细胞活力，由IRE1激活的JNK诱导的凋亡在siPERK细胞中被消除，说明在PERK和IRE1分支之间存在一个正反馈回路。因此，应激可诱导细胞自噬依赖性存活，但应激水平过高会导致细胞死亡。内质网应激下的自噬与凋亡相互串扰，则可维持细胞内稳态。

由于内质网应激诱发自噬与凋亡涉及神经退行性疾病、恶性肿瘤、糖尿病等，故关注内质网应激引起的生死决策具有重要意义。目前，虽然对内质网应激介导的自噬和凋亡途径及其信号网络间相互作用的认知有了明显提高，但在临床治疗中的应用仍然有限，未来需要进一步阐明内质网应激诱导的自噬与凋亡的分子机制及其与疾病的关系，并积极研发具有拮抗作用的靶向药物，从而为疾病的治疗提供新的方法。