化学发光微粒子免疫分析法、酶联免疫吸附法在丙肝病毒抗体检测中的应用对比观察

薛海玲，曾昭伟，孙兰菊，常艳敏

(天津市南开医院,天津300100)

丙肝病毒(HCV)属于黄病毒科(flaviviridae)肝炎病毒属(hepacivirusgenus)，其基因组由约9.6×103个核苷酸的单股正链RNA构成。HCV感染引起的丙型肝炎呈全球性流行，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为2.8%，约1.85亿人感染HCV，每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例[1～3]。我国年龄≤59岁的一般人群HCV-Ab阳性率为0.43%。血液透析患者、HIV感染者、静脉药瘾者等特殊和高危人群HCV-Ab阳性率分别为20%～50%、60%～90%和70%～90%，故我国约有1 000万例丙肝患者。丙肝感染具有隐匿性，因此大量HCV感染者未被发现，同时丙肝慢性化率为55%～85%，病程20年出现肝硬化的比例为5%～15%，肝硬化失代偿年发生率为3%～4%，肝癌年发生率为2%～4%[4，5]。早期诊断已成为预防和控制丙肝传播的关键手段之一。目前常用的实验室检测方法有HCV抗原检测、抗HCV血清学检测以及HCV RNA检测。其中抗HCV血清学检测是应用比较广泛的实验室检测方法，包括常用的酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光试验(CLIA)、胶体金快速实验以及重组免疫印记试验(RIBA)。第3代ELISA检测试剂增加了NS5区蛋白抗原，联合HCV核心抗原、NS3和NS4抗原，明显提高了抗体的覆盖率，同时也提高了检测的敏感度和特异度[6]。RIBA具有较高的特异度，但灵敏度不及化学发光法高，同时操作繁琐且价格昂贵，国内临床开展得较少。HCV RNA可作为HCV复制的直接指标，是检测HCV感染后确诊和评估病毒复制水平及抗病毒治疗效果的主要手段，检测窗口期1～3周，而第三代ELISA、化学发光法检测的HCV感染窗口期分别为60 d和20～25 d[7,8]，相比之下，RNA检测窗口期明显提前。但HCV RNA检测操作繁琐、成本高，难以作为筛选试验在常规实验室普及[9]。美国疾控中心推荐使用RIBA和HCV RNA检测作为补充和确认试验[10]。在条件容许的情况下，应首选HCV RNA定量检测，避免RIBA检测阳性后因治疗原因须进一步检测病毒载量[11]。目前，CLIA中的化学发光微粒子免疫分析(CMIA)也开始应用于抗HCV检测，其精密度和准确度高、高通量、可随机进样、操作简单[12，13]。ELISA、CMIA用于HCV筛查的灵敏度和特异度均较高，但究竟哪种方法更适合作为现阶段临床HCV-Ab的初筛试验，相关报道较少。我们综合对比了ELISA、CMIA两种初筛方法测定HCV-Ab的效果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择南开医院2018年7～12月收治的190例疑似HCV感染者，临床症状符合中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会联合修订的《丙型肝炎防治指南2015年更新版》的HCV症状[4]。190例均留取血清，收集无菌EDTA抗凝血，留取血浆，-80 ℃备用。收集529例健康查体者的空腹促凝血标本529份。本试验已经通过医院伦理委员会审查。

1.2 试剂与仪器 HCV质控品(康彻思坦的标准物质,批号为201710003)；HCV抗体诊断试剂、HCV校准品； ELISA HCV抗体诊断试剂盒(北京万泰生物工程股份有限公司)； i2000微粒子化学发光全自动免疫分析仪(美国雅培);酶标仪(日本,B IOIADMODEL-680型)；DEMⅢ型洗板仪(北京拓普分析仪器有限公司)；酶标仪EXL800(美国Bio-Tek公司)；实时荧光PCR仪(ABI7500)。

1.3 HCV-Ab检测方法 分别采用CMIA法、ELISA法检测190例份疑似HCV感染、529例份健康查体者空腹促凝血HCV-Ab。

1.3.1 CMIA法的操作及结果判断 CMIA法测HCV-Ab采用雅培i2000全自动化学发光免疫分析仪进行检测，试剂盒为抗-HCV的CMIA检测试剂盒，采用双抗原夹心法，以顺磁性微珠作为包被载体包被抗-HCV后，与标本中的抗-HCV结合，加入吖啶酯标记的抗-HCV后，在特定的磁场区发生沉积，经反复洗涤使游离抗原或抗体与抗原抗体复合物分离，加入预激发液与激发液后，可以测定其激发光强度。S/CO>1.0为阳性。

1.3.2 ELISA法的操作及结果判断 取血液标本，设置阴性对照3孔、阳性对照2孔和空白对照1孔，每孔加样本稀释液100 μL，待测样本10 μL，37 ℃孵育60 min，洗板后加酶结合物100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板后加显色液100 μL，37 ℃孵育30 min洗板后加终止液50 μL，ELISA法以主波长450 nm，副波长630 nm进行比色。Cutoff值=阴性对照孔平均值+0.12。S/CO>1.0为阳性。

1.4 HCV RNA确认试验 对190例份疑似HCV感染者空腹抗凝血血标本进行确认试验，采用RFQ-RT-PCR检测HCV RNA。检测灵敏度为10～50 IU/mL，结果判断：>5.0E+2 IU/mL为阳性。

1.5 ELISA、CMIA法检测 HCV-Ab的效能分析 ①精密度[13～15]分析:依照CLSI EP15-A2文件[16]，对两种方法的批内和批间精密度进行评价比较。批内精密度试验，选取高、低2个浓度水平，充分混匀，对每个水平重复测定20次；批间精密度试验，选取高、低2个浓度水平，充分混匀重复10 d，每天每个水平重复测定2次，共20次。②灵敏度分析:绘制浓度与S/CO曲线分析CMIA法、ELISA法检测HCV-Ab的灵敏度。将卫生部室间质评血清进行倍比稀释，每个稀释度样本分别用ELISA和CMIA重复检测10次，结果取平均值。以抗体浓度为横坐标，S/CO值为纵坐标，绘制浓度与S/CO的曲线。③特异度分析:根据529例健康查体者(已与临床确认无HCV感染)ELISA、CMIA法检测结果，采用特异度实验分析CMIA法、ELISA法检测HCV-Ab的特异度。④一致率比较: 跟据190例份疑似HCV感染、529例份健康查体者ELISA、CMIA法检测结果，计算阴性、阳性一致率及总一致率。

1.6 统计学方法 采用SPASS19.0统计软件。计量资料以M表示，比较采用Mann-Whitney检验;计数资料以百分比表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

190例份疑似HCV感染者标本中CMIA法检测阳性、阴性分别为190、0例，ELISA法分别为145、45例；529例份健康查体者标本中CMIA法阳性、阴性分别为0、529例，ELISA法分别为156、563例。

CMIA法、ELISA法检测HCV-Ab的批内精密度水平1分别为4.70%±0.27%、7.11%±0.90%(t=11.495，P<0.05)，水平2分别为19.10%±0.59%、22.08%±2.22%(t=5.844，P<0.05)，CMIA法、ELISA法检测HCV-Ab的批间精密度水平1分别为4.64%±0.16%、6.71%±0.81%(t=10.910，P<0.05)，水平2分别为19.11%±0.48%、21.39%±1.67%(t=5.968，P<0.05)。

将质控物倍比稀释到1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128时，ELISA法检测HCV-Ab所得S/CO均值分别为3.89、1.05、0.31、0.06、0、0、0、0，CMIA法检测HCV-Ab所得S/CO均值分别为5.24、3.87、1.78、0.97、0.66、0.43、0.20、0.18。CMIA法、ELISA法检测HCV-Ab的S/CO比较，U=13.08，P<0.05。ELISA在稀释度为1∶4时，测得S/CO为0.31<1.0，判定结果为阴性，而CMIA在稀释度为1∶4时，测得S/CO为1.78>1.0，判定结果为阳性。

529例份健康查体者空腹促凝血标本中CMIA法、ELISA法分别检出阴性为529、518例，临床特异性分别为100%、97.92%(χ2=9.186，P<0.05)。两种方法阴性一致率为97.92%，阳性一致率为76.32%，总一致率为92.21%(χ2=4.400，P<0.05)。

190例份疑似标本中HCV RNA阳性检测率为59.47%(113/190)。CMIA法检测HCV-Ab：0

3 讨论

本研究通过灵敏度试验比较，当质控血清稀释比例为1∶4时，CMIA法检测HCV-Ab的S/CO为1.78>1.0，结果判定为阳性；而ELISA法的S/CO为0.31<1.0，判定结果为阴性。经统计学分析，CMIA法的灵敏度高于ELISA法，较高的灵敏度大大减少了临床检测HCV-Ab的漏检率。据报道[17～19]，雅培公司生产的CMIA法检测HCV-Ab试剂盒灵敏度为94.44%～100%，高于国产ELISA试剂盒。本研究两种方法检测HCV-Ab的特异度均大于96%，与相关报道[20]一致，经统计学分析，CMIA法检测HCV-Ab的特异度高于ELISA法。精密度试验比较中，我们可以看出CMIA法检测HCV-Ab的批内和批间精密度均高于ELISA法，可见CMIA法检测HCV-Ab的结果更稳定，重复性更好。

两种方法检测HCV-Ab的阴性一致率为97.92%，阳性一致率为76.32%，总一致率为92.21%，阳性一致率略低于相关报道，但总一致率比较接近[21]。CMIA法检测HCV-Ab，当1.0≤S/CO<5.0时，与ELISA检测的阳性符合率仅为58.33%(63/108)，此范围内的45例阳性标本用ELISA检测时为阴性，且全部集中在1.0≤S/CO<2.0的范围内，可见ELISA的灵敏度不如CMIA，ELISA更容易造成一定的漏检率，出现这种情况的可能原因：ELISA包被的多肽结构片段抗原非高度特异性；ELISA试剂盒包被抗原不纯或酶标二抗纯度低。在此范围外的阳性结果，即S/CO>5.0时，与ELISA的阳性符合率为100%，由此可见当S/CO<5.0，即为弱阳性范围内时，两种方法的阳性符合率低，S/CO>5.0时，两种方法的阳性符合率升高，达到100.00%。

CMIA检测HCV-Ab的灵敏度较高，不易造成漏检，但也可能存在一定的假阳性，尤其是S/CO<5.0的弱阳性标本假阳性率更高。因此对于假阳性的标本美国疾控中心推荐使用RIBA或HCV RNA检测作为补充和确认试验。本试验使用HCV RNA检测进行补充试验。

对190例疑似标本检测HCV RNA后发现，CMIA总符合率为54.21%，随着S/CO比值的升高，RNA检测的阳性率呈上升趋势。本研究中190例份疑似标本中，S/CO<5.0的弱阳性标本中假阳性率81.97%，相关报道[21]中提到，CMIA弱阳性标本中有42%～71%的样本经确证为假阳性，本试验结果假阳性率略高，造成这种情况的可能原因：患者处于窗口期或恢复期，RNA水平低于检测范围；RNA检测过程中被空气中的RNA酶降解；RNA检测试剂盒灵敏度较低。在61例弱阳性标本中，经RNA确认为阴性的50例标本集中在S/CO<3.0 范围内。由此可见S/CO<3.0时，CMIA的假阳性率最高。

ELISA的检测结果中，随着S/CO比值的升高，RNA检测HCV-Ab的阳性率也呈上升趋势。190例份疑似标本中，ELISA检测出45例阴性，经RNA确证试验，发现17例为阴性，28例为阳性，假阴性率为62.22%。造成较高假阴性的原因可能有：ELISA手工操作中温育时间短；包被的多肽结构片段抗原的非高度特异性；试剂盒包被抗原不纯或酶标二抗纯度低。ELISA法阳性标本中，S/CO<3.8的弱阳性标本假阳性率为89.29%。

对比两种检测方法，CMIA法HCV RNA阳性检出率高于ELISA(P<0.05)，即两种方法在整体阳性预测上具有显著差异。由此可见，CMIA法检测HCV-Ab的阳性预测值高于ELISA法，有更高的可信度。

与确证试验比较，随着S/CO比值的增加，两种方法阳性的标本RNA检测阳性率相应升高。美国CDC[11]曾经指出，应用三代EIA试剂盒和CMIA试剂盒检测HCV-Ab，当S/CO分别≥3.8和S/CO≥5.0时，真阳性预测值均≥95%，上述S/CO值可被用于预测更高特异性的补充实验的结果。本研究发现，ELISA法、CMIA法的S/CO分别≥5.0和≥8.0，有较高的真阳性预测值，由此可见S/CO比值在上述范围内，对丙肝阳性的预测有一定的参考意义。S/CO比值越高，补充试验阳性的可能性越大；反之假阳性的可能性越高。综合本研究结果以及我院仪器水平和综合环境等因素，我们推荐使用S/CO比值1.0～8.0作为CMIA的灰区范围，推荐使用S/CO比值1.0～5.0作为ELISA的灰区范围。对于灰区范围内的阳性结果，对于复查仍在灰区者，首先要除外标本因素如是否溶血、黄疸、乳糜和离心不足等干扰因素的存在；也要除外人为的操作因素等假阳性因素。有条件的实验室，建议做RIBA和HCV RNA检测作为补充和确认试验，再进行报告。

本试验中，HCV RNA检测的阳性率为54.21%，低于本试验的CMIA、ELISA法检测的HCV-Ab阳性率，同时也低于相关文献[22]报道，推测可能的因素：有些患者处在HCV感染的急性期与慢性期转换中或者HCV感染恢复期时无法检测到[18]；有些患者经长期治疗，病毒含量较低；PCR操作过程中，自然界广泛存在的RNA酶导致RNA降解等影响因素，使扩增效率降低。因此，仅凭借RNA检测来确认HCV-Ab筛查阳性与否可能存在一定误判风险。我们认为，有能力的实验室除使用RNA检测外，还可使用RIBA等补充血清学检测，几种方法联合使用，以提高临床丙型肝炎诊断的准确率。除了HCV RNA检测，HCV-Ab检测外，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和白蛋白等生化检测结果的变化也与HCV的存在相关[4]，可以辅助判断抗体筛查结果。

与ELISA法相比，CMIA法检测HCV-Ab的优点有：精密度CV变化小，重复性较好，测定结果较稳定；有较高的灵敏度和特异度；较低漏检率；假阳性率和假阴性率较低；有更高的阳性预测值。除此之外，CMIA法可全自动化操作、操作简便、可进行单份标本检测，反应时间短(17 min)、可定量检测、脱磁清洗、干扰物影响少、降低了操作人员感染的风险；可进行定量测定，最小可测值达pg水平，检测窗口期短，也使抗病毒治疗的监测成为可能。

综上所述，作为实验室检测HCV-Ab的初筛方法，CMIA法比ELISA法有更多优势，值得进行推广，必要时采用多种方法联合检测，同时选择特异度更高的补充试验进行确证，以期为临床医生提供更准确的结果，有利于HCV感染的早期诊断和治疗。