miRNA与肾纤维化关系的研究进展

郭雪梅，张诗琬，喻雪琴，敬雪明

(川北医学院附属医院，四川南充637000)

我国成年人慢性肾脏病患病率约为10.8%,其中多数患者发展为终末期肾衰竭，基本病理变化为肾纤维化。研究发现,人体至少有1 000种miRNA并调控人类60%的基因[1]，miRNA通过抑制基因转录或沉默相应mRNA调控特定靶基因表达，对细胞活化、增殖和凋亡发挥调节作用，miRNA表达异常将致细胞功能受损和肾纤维化、肿瘤、糖尿病等发生。研究显示，部分特定miRNA可多途径调控肾纤维化的发生发展。转录生长因子-β(TGF-β)/Smads是促肾纤维化发生的最主要信号通路，miRNA通过对靶基因调节，可双向作用于TGF-β/Smads等信号通路对肾纤维化形成发挥调控作用。研究发现，肾纤维化患者和肾纤维化大鼠模型肾组织及外周血中部分miRNA表达失常并与肾纤维化关系密切。miRNA的发现为诊断、治疗及评估肾纤维化提供了新思路。现就miRNA在肾纤维化中机制的研究进展进行综述。

1 miRNA的生物学特征

miRNA lin-4是Lee等[2]在1993年发现的一种小分子非编码RNA。miRNA含有18～25个核苷酸，表达于机体各个组织和器官，具有高度保守性、组织时序性，可调节多种细胞的表观遗传；同时miRNA也具有显著的组织特异性，不同组织器官中miRNA水平表达差异明显。研究发现，miR-21、miR-192、miR-200家族等在肾纤维化组织中呈特异性高表达并参与了肾纤维化的发生发展过程。其可能路径是：首先核内特定基因或编码蛋白质基因被RNA聚合酶Ⅱ转录为双链pri-mRNA，然后pri-mRNA在胞核内被转录为含70个核苷酸的双链pre-mRNA；随后pre-mRNA从胞核内进入胞质中，接着被裂解为含22个核苷酸的双链miRNA；最后双链miRNA经过选择与RNA诱导的沉默复合物形成miRNA诱导的沉默复合物并在底物作用下发挥调节功能。

靶mRNA的3′UTR序列在与miRNA特异性地结合后发挥对基因表达的调控作用， miRNA对转录后基因水平表达起负性调节作用，参与细胞活化、增殖、转化、凋亡及脂质代谢等过程，与肾纤维化、肿瘤、糖尿病等疾病的发生发展相关。miRNA在肾纤维化患者中还参与了血压稳定和电解质平衡调节，通过诱导肾素高表达使肾小球旁细胞切酶失活调节肾纤维化的发生。miRNA在机体血清、尿液、唾液及其他体液中可检出并稳定表达，其表达水平与疾病间存在一定相关性，可作为疾病早期诊断的生物标志物和治疗的潜在靶点。

miRNA通过诱导作用，促进其参与形成的微小RNA诱导的基因沉默复合体(miRISC)识别并结合于靶mRNA的3’端非转录区，再通过序列互补机制对靶基因表达进行负性调控。若miRNA与靶mRNA间互补完全，靶mRNA被miRISC直接裂解；若与靶mRNA部分互补，miRISC则对基因转录发挥抑制作用。但研究发现[3]，在细胞静息状态时，miRNA-369-3可诱导miRISC中的FXPL蛋白和AG02蛋白与靶mRNA结合而促进活化对靶mRNA发挥转录作用，推测miRNA在细胞不同状态下对靶细胞的调节作用不同。

2 miRNA与肾纤维化

肾脏肌成纤维细胞(MF-HSC)是形成细胞外基质(ECM)的最主要来源细胞，MF-HSC来源于纤维细胞、外膜细胞、血管周围细胞及间充质细胞等。同时，miRNA、结缔组织生长因子(CTGF)、TGF-β也可与相应受体作用后直接或间接地活化相应信号通路促肾纤维化发生，而子宫敏感性相关基因(USAG)和BMP-7可抑制肾纤维化的发生与进程。miRNA通过对TGF-β/Smad等信号通路活化促进间充质细胞转化(EMT)为MF-HSC。在肾纤维化形成过程中，miRNA直接或通过对信号通路调节等多途径、多交叉参与肾纤维化的发生。

2.1 miRNA在肾脏中的表达 首先，部分miRNA在肾脏中出现不同的特异性表达。如miR-192、miR-215、miR-146a等在肾组织中高表达且远高于其他组织，其中miR-192d等在肾皮质中的表达水平是肾髓质的20倍；另外，肾组织中的miR-21、miR-130、miR-200a等均出现不同水平表达[4]。其次，肾纤维化信号通路中的相关靶基因与miRNA表达谱相关[5]。如miR-21、miR-29等特定基因对炎性细胞浸润、细胞因子表达异常、细胞增殖分化凋亡、ECM形成与降解失常等肾纤维化形成相关环节产生调控作用。

2.2 miRNA对ECM形成的影响 ECM的过度沉积是肾纤维化形成的根本特征，其保持ECM形成与降解的动态平衡是维持肾组织结构稳定的重要因素，肾纤维化是ECM形成大于降解而导致ECM过度沉积的结果。ECM的形成受两种蛋白级联调节：一是基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)，另外是丝氨酸蛋白酶纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制因子(PALs)，二者间的平衡状态对ECM的形成影响较大。

2.2.1 miRNA对ECM形成的促进作用 目前miRNA对肾纤维化影响主要集中在ECM形成与降解失衡方面，并通过miR-21、miR-29、miR-192等参与ECM水平调节，但miRNA对ECM的调节受多因素、多路径影响。研究发现，miR-29s能与ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ mRNA的3′UTR结合来抑制蛋白质转录下调纤维胶原蛋白水平而发挥抗肾纤维化作用。Wang等[6]研究发现，在肾纤维化小鼠肾组织中miR-21高表达并与TIMP-1正相关，与MMP-9负相关，推测miR-21可调节MMP-9/TIMP-1失衡状态而参与肾纤维化形成。在对糖尿病与非糖尿病肾纤维化大鼠模型研究发现，miR-21对PI3K-PTEN信号通路发挥抑制作用，促进Ⅰ型胶原蛋白高表达而促进ECM形成[7]。miR-21有促进肾纤维化形成的作用。在肾小管上皮细胞中，TGF-β可通过Smad 3促进miR-21高表达，高表达的miR-21又可促进TGF-β表达来诱导胶原纤维蛋白-Ⅰ和a-SMA高表达而致ECM形成；同时，沉默miR-21后胶原纤维蛋白-Ⅰ和a-SMA低表达，抑制ECM形成。大鼠单侧输尿管结扎后发现其肾组织中miR-21水平与肾纤维化程度正相关[8]。用TGF-β处理糖尿病小鼠肾小球与体外小鼠系模细胞后，miR-192、胶原纤维蛋白-Ⅰ、a-SMA水平上调，ECM形成增加，从而促进肾纤维化发生。在糖尿病小鼠肾脏中，下调miR-192水平可降低胶原纤维蛋白-Ⅰ、a-SMA、TGF-β水平而抑制ECM形成。小鼠系膜细胞研究发现[9]，miRNA-let7b通过对Col1a2、Col4a1的直接作用，促进糖尿病肾病肾组织中胶原纤维高表达而促进ECM形成。miR-132可诱导肾血管周围细胞向MF-HSC转化增殖而促进ECM形成，推测沉默miR-132可能为抗肾纤维化治疗的新靶点。

2.2.2 miRNA对ECM形成的抑制作用 miRNA除了具有促进ECM形成的作用外,miRNA也具有抗肾纤维化作用。miR-29可抑制TGF-β与下游靶基因CTGF结合,抑制ECM形成并促进ECM降解而缓解肾纤维化程度。研究发现，在肾近端小管细胞系NRK52E中Smad 7高表达， miR-21、miR-192下调，miR-29b高表达，抑制ECM形成。沉默Smad 7后，肾组织中miR-192和miR-21高表达，miR-29b低表达，促进ECM形成，小鼠肾纤维化程度加重。TGF-β通过激活下游信号分子Smad 2、Smad 3，诱导miR-21高表达，抑制miR-29、miR-200表达而降低ECM形成[10]。miR-21可直接下调TGF-β/Smads信号通路中的Smad 7水平，促进α-SMA和ECM高表达，诱发和促进肾纤维化发生[11]；miRNA-let7b 可靶向抑制TGF-β而降低Smad 3活性，抑制TGF-β表达水平、降低ECM形成而发挥抗肾纤维化作用[12]。

2.2.3 miRNA对炎性细胞因子水平的调节 研究发现，在TGF-β诱导下,miR-21能促进ECM形成和α-SMA高表达。在成纤维细胞中,ERK/MAP激酶信号活化可能是miR-21促进肾纤维化形成机制之一，沉默或下调miR-21水平可抑制啮齿动物肾纤维化模型的肾纤维化程度和减轻肾组织炎症程度[13]。沉默miR-21的肾组织中, 脂类代谢、脂肪酸氧化还原能力增强与miR-21水平负相关,显示miR-21可通过调节代谢途径来调控肾纤维化发生[14]。敲除miR-21的质粒转种到梗阻性肾病后，其肾纤维化程度降低，显示调节miR-21水平可能是抗肾纤维化治疗的新途径[15]。miR-21在肾细胞中高表达可促进肾组织炎症发生,沉默miR-21后肾组织炎症减轻和巨噬细胞浸润减少[16],这可能与抑制miR-21后促炎细胞程序性细胞死亡-4(PDCD4)低表达抑制巨噬细胞浸润相关。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可通过上调TGF-β表达诱导EMT并促进肾纤维化发生。NRK52E在AngⅡ诱导下miR-29b低表达并抑制细胞中TGF-β高表达，miR-29b 通过抑制AngⅡ间接抑制TGF-β/Smads通路降低ECM形成。研究发现，AngⅡ诱导下的小鼠肾小球中miR-30s低表达，miR-30s高表达时可抑制AngⅡ水平而缓解肾小球炎症。

2.3 miRNA对EMT的影响 肾纤维化发生的主要效应细胞是成纤维细胞。在病理状态下，成纤维细胞的活化、增殖致ECM形成而发生肾纤维化。目前对于成纤维细胞来源有不同观点，多数学者认为其主要来源于活化的间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞、肾小球内皮细胞等。在miRNA表达谱中，miR-21可正向调控TGF-β促进ECM形成，但miR-21需在TGF-β活化后才能发挥作用。肾组织中高表达的miR-29b可抑制TGF-β诱导胶原纤维和ECM形成[17]。miR-155 需与特异靶点RhoA结合参与TGF-β/Smad对EMT调控，沉默正常小鼠乳腺上皮细胞中miR-155后可抑制TGF-β诱导EMT发生[18]。低氧状态可诱导肾上皮HK-2细胞miR-155高表达并伴随α-SMA、TGF-β水平上调[19]，显示miRNA可能在调节EMT进程中发挥调节作用。

3 miRNA对调控肾纤维化信号通路的影响

目前，TGF-β/Smads信号通路是公认的最主要致肾纤维化发生的通路[20]。TGF-β作为最重要的促肾纤维化因子，通过诱导肾小球系膜细胞增殖、MF-HSC活化与增殖以及EMT、ECM形成等途径来促进肾纤维化发生[21]。TGF-β受体效应蛋白Smad(2、3、4、7)在肾纤维化中发挥了调控作用。Smad 2、Smad 3在肾纤维化患者和肾纤维化小鼠组织中高表达；Smad 4处于TGF-β/Smads信号通路的关键位置，发挥抗炎、抗肾纤维化作用；Smad 7为TGF-β负反馈调控因子，与Smad 2、Smad 3竞争结合活化TβR-Ⅰ而抑制TGF-β/Smads活性。

3.1 miRNA与TGF-β/Smads信号通路调节对肾纤维化的影响 肾纤维化的主要特征是成纤维细胞活化和ECM过度沉积，其中TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等多信号通路参与了肾纤维化形成[22]。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三个亚型，TGF-β1丰度最高、活性最强。激活的TGF-β1与TβR-Ⅱ结合后活化TβR-Ⅰ并磷酸化下游的Smad 2/3基因，磷酸化的Smad 2、 Smad 3解离与Smad 4融合成异源二聚体并进入胞核而调节靶基因转录，Smad 7为一种抑制性Smad，能使TβRI和Smads发生裂解而对TGF-β/Smad通路进行负调控[23]。TGF-β通过诱导ECM形成、抑制MMPs并诱导TIMPs表达而抑制ECM降解、参与EMT而诱导MF-HSC形成、诱导成纤维细胞活化等机制来促进肾纤维化形成，在肾纤维化形成过程中TGF-β始终处于高表达状态[24]。

3.2 miRNA与TGF-β/Smads信号通路在肾纤维化发生中的作用 目前，miRNA如何通过调节TGF-β/Smads信号通路来调控肾纤维化的机制还不清楚。研究发现，miRNA与TGF-β/Smad信号通路间的调节是相互的，miRNA通过诱导TGF-β信号通路活化促进TGF-β高表达而致肾纤维化的发生。肾纤维化患者中，TGF-β通过Smad 3促进miR-21、miR-192高表达, miR-29低表达，抑制肾小管内皮细胞Smad 7表达。Smad的抑制剂Smad 7可维持miR-29b功能，抑制miR-21，miR-192表达，防止肾纤维化发生。肾组织炎症时，TGF-β诱导miR-21高表达并抑制Smad 7表达，增强TGF-β信号通路活性，促进ECM形成而致肾纤维化发生。在成纤维细胞中，miR-21可增强TGF-β/Smad通路活性促进TGF-β的致肾纤维化作用,但同时也存miRNA对TGF-β表达的负性调控作用。研究发现，miR-196a/b在沉默TGF-β/Smad 信号通路后，胶原纤维蛋白-Ⅰ和a-SMA水平低表达，ECM低表达而肾纤维化程度减轻。在大鼠肾纤维化模型中，miR-133在与CTGF 结合后，通过抑制TGF-β/Smad路径来降低肾纤维化形成。通过转染miR-26a人足细胞的体外培养发现，CTGF 水平下调明显，miR-26a直接抑制CTGF表达而抑制TGF-β/Smads通路活性来抑制ECM形成。

3.3 miRNA对Wnt/β-catenin信号通路调控肾脏纤维化的影响 Wnt/β-catenin为一种高度保守而能调节细胞增殖、器官发育、组织损伤和修复的信号通路，其在正常肾组织中不表达，在肾组织损伤或炎症大鼠肾模型及人肾功能失调时被活化。研究发现，Wnt/β-catenin与肾纤维化发生和进展关系密切并促进了血纤维蛋白酶原激活物抑制因子-1以及MMP-7等多种促/抑纤维基因表达。血管紧张素可直接作用于下游Wnt/β-catenin通路促进肾纤维化的发生，抑制Wnt/β-catenin传导通路可在大鼠肾纤维化模型中减轻肾损伤和纤维化形成与程度，抑制Wnt/β-catenin通路可能成为肾纤维化治疗的潜在靶点[25]。

总之，miRNA与肾纤维化间关系密切，miRNA具有组织特异性和对靶基因调控的专一性，特定miRNA有望成为抗肾纤维化治疗的潜在靶点。但是，肾纤维化的发生受多因素影响，miRNA与促/抗纤维化因子间关系复杂，目前也只发现了少数特定miRNA在肾纤维化中的初步作用机制，主要集中在TGF-β/Smad信号通路上，且研究结果也存在差异。因此，miRNA在肾纤维化中的确切作用机制及其抗肾纤维化治疗新靶点的应用还需要进行深入研究。