差异蛋白质组学在神经系统疾病生物标志物筛选中的研究进展

安东,袁正伟

(1中国医科大学附属第一医院，沈阳110001；2中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室)

蛋白质组学是在大规模水平上对某一特定细胞、组织、体液中所有蛋白质进行研究的学科。基因组学、蛋白质组学、代谢组学分别从基因、蛋白质和代谢产物角度研究，共同构成现代生物研究的重要手段，为生命科学的发展提供了广阔前景[1]。差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的主要策略之一，借助该技术可以筛选出不同因素引起的样本之间的差异蛋白质谱，同时获得对某些关键蛋白的认识和功能分析。作为研究生命现象的手段和方法，差异蛋白质组学技术对发现疾病诊断标志物、研究疾病发病机制、寻找新的靶向治疗药物有重要的应用价值。神经系统是人体非常复杂的器官系统，神经系统的疾病种类多样，临床表现各异，病因复杂，发病机理不清，诊断和治疗都面临巨大挑战。差异蛋白质组学技术能从众多复杂的基因和蛋白质中筛选出一组改变明显的关键性分子，找到疾病发生、发展的候选标志物。现就差异蛋白质组学研究的主要技术手段以及该技术在神经系统领域的差异蛋白质组学分析研究综述如下。

1 差异蛋白质组学技术

1.1 基于双向凝胶电泳(2-DE)定量技术 传统2-DE技术其原理是根据等电点和分子量两个方面将蛋白质进行分离。随着技术进展，出现了荧光差异凝胶电泳(DIGE)。DIGE的技术原理是将荧光染色技术与双向电泳技术相结合，首先对测试样品用不同荧光染料标记，然后将混合样品在同一块凝胶上进行双向电泳，使测试样品的蛋白质在同一平面显示不同的荧光，从而区分蛋白质点不同荧光的差异，实现蛋白质的相对定量。该方法与传统的2-DE相比有助于完全二维分析和量化，克服了其重复性差的问题。但DIGE只适用于标记含有赖氨酸的蛋白，否则将使用特殊荧光染料，费用较为昂贵。

1.2 基于液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)定量技术 目前基于LC-MS/MS定量技术飞速发展，已经成为蛋白质组学研究的主要分析手段，其灵敏度更高、检测范围更大，且检测速度快、自动化程度高，可以实现蛋白质组学研究高通量、高深度的要求。其方法进一步分为两种:非标记定量技术和稳定同位素标记定量技术。

1.2.1 非标记定量技术 非标记定量通过比较样品中蛋白质酶解后多肽的质谱分析次数或质谱峰强度进行定量分析。该技术包括两种定量方法。基于二级谱图的非标记定量技术利用蛋白肽段匹配的二级谱图计数实现蛋白定量，基于一级质谱的非标记定量是比较一级谱图中的质谱峰面积强度或离子信号强度进行相对定量。非标记定量所需样品制备简单、无需标记、试验速度快、成本较低。近年来，基于一级质谱的蛋白质非标记定量技术随着配套数据处理软件和程序不断开发，该技术得到了较广泛的应用。但是在高丰度蛋白存在时,谱图数可能达到饱和造成结果不准确，且只依据一级质谱和数据模型定量，准确率不高，且重现性差[2]。

1.2.2 稳定同位素标记定量技术 是向测试样品中引入稳定同位素标记，通过比较不同同位素标记物的质谱信号强度实现不同样品中蛋白质的相对定量分析。稳定同位素标记方法与相对非标记定量相比，定量更为准确，重复性好。根据同位素标记引入方式的不同，分为体内标记和体外标记两类。细胞培养中稳定同位素标记氨基酸(SILAC)是经典的体内标记定量技术，其原理是利用轻、重同位素标记的必需氨基酸培养细胞，细胞经过若干次传代，细胞内新合成蛋白质被同位素稳定标记，然后将样品混合，根据两种不同同位素标记肽段的面积或峰强度比实现对蛋白质的相对定量。SILAC技术可以把时间维度与定量蛋白质组学相结合，从而对蛋白质组动态变化进行研究。体外化学标记常用方法主要有基于一级质谱的同位素亲和标签(ICAT)技术、基于串联质谱的等重同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术和串联质量标签(TMT)技术等。ICAT技术通过特异性结合半胱氨酸琉基的ICAT试剂来标记肽段，而后进行分离纯化和质谱鉴定，根据一级质谱图中标记肽段的面积比实现相对丰度的定量。该技术可以简便、快速、准确比较样品中球蛋白的表达。基于串联质谱的iTRAQ标记技术是目前差异蛋白质组学研究中应用最广的技术，所采用的标本来源广泛，可将脑组织、脑脊液、血浆、细胞、体液等各种样品中的蛋白质经胰蛋白酶酶切为多肽后用iTRAQ标记，通过比较第二级质谱中不同样品的报告离子峰强度进行相对定量分析。具有灵敏度高、标记效率高、蛋白质覆盖率高，数据丰富，定量准确、可信度高、重复性好等优点[3]。通过在样本中加入已知量的经iTRAQ标记的标准品做内标，还可进行蛋白质的绝对定量。基于iTRAQ技术的差异蛋白组学研究方法已成为发现疾病生物标志物的主要分析手段。TMT试剂与iTRAQ 试剂的原理类似，可以对2组、6组、10组样品同时进行标记。目前TMT 试剂在蛋白质组学研究中应用日趋增长，该定量技术还可以通过与高分辨质谱技术和其他标记技术相结合，实现更高通量、更深精度的蛋白质组学定量分析[4]。

2 差异蛋白质组学技术在神经系统疾病生物标志物筛选中的应用

生物标志物作为机体在疾病状态下的分子信号，可以呈现为体液中的循环物质，也可以定位于细胞内部，是诊断、监测疾病、评估治疗和判断预后的重要标志。利用差异蛋白质组学可以在组织或体液中进行定性、定量研究,高通量筛查出系列特异生物分子。这些生物标志物可以应用于神经系统肿瘤、神经退行性疾病、神经缺血损伤、神经发育畸形的诊断及治疗。

2.1 神经系统肿瘤 确诊中枢神经系统肿瘤通常需要活检，基于蛋白质组学技术寻找血浆标志物作为一种非侵入性的诊断手段成为现今的研究热点。目前对神经系统肿瘤(如多形性胶质细胞瘤、星形细胞瘤)蛋白和基因的表达已有很多研究。Miyauchi等[5]用SWATH 质谱技术分析比较了胶质瘤患者与正常人群血浆差异蛋白，结果发现LRG1、C9、CRP、GSN、IGHA1、APOA4具有较好的诊断价值，并且发现LRG1、CRP、C9与肿瘤大小呈明显正相关。Petushkova等[6]利用蛋白翻译后修饰组学研究发现了胶质母细胞瘤患者血浆乙酰化和泛素化修饰的异常。Polisetty等[7]应用高分辨质谱技术分析了弥漫性星形胶质细胞瘤的差异膜蛋白组，与已报道的转录组数据比对，发现190种差异蛋白在两组不同组学数据中表达趋势一致。在新近研究中，Spreafico等[8]用脑脊液蛋白质组鉴定了儿童脑肿瘤扩散转移的预测标记物，其中验证了6种蛋白(1型胶原、胰岛素样结合蛋白4、前胶原 C-肽链内切酶增强子1、神经胶质细胞系衍生神经营养因子受体α2、胰蛋白酶α抑制剂重链4、神经增殖和分化控制蛋白-1)在肿瘤转移病例组与对照组有显著差异。2017年Gu等[9]比较了来源于Ⅳ期髓母细胞瘤患儿的原发肿瘤和转移肿瘤细胞系的差异蛋白，结果发现1 400种显著变化的差异蛋白，这些差异蛋白包括一些已知的对肿瘤转移有促进或抑制作用的蛋白，同时也发现了大量未知作用的蛋白，此为将来进一步研究髓母细胞瘤转移标记物提供了线索。

2.2 神经退行性疾病 神经退行性疾病发病率近年有明显的上升趋势，由于其发病机制尚不清楚，治疗也缺乏有效方法和手段。由于脑脊液与脑组织中细胞外液直接相连，中枢神经系统发生病变时，会影响脑脊液中的组成成分，因此检测脑脊液蛋白质组学对中枢神经疾病的诊断、治疗和预后判定具有重要意义。脑脊液蛋白质组学的研究代表了对中枢神经系统生理及病理变化认识层次的深入。Abdi等[10]利用iTRAQ 标记技术通过脑脊液蛋白质组学研究了神经退行性疾病阿尔茨海默病(AD)、帕金森病和路易体痴呆征患者脑脊液中蛋白质表达的差异，检测鉴定出1 500多种蛋白质，发现了大量的差异蛋白，验证结果显示多种标志蛋白质联用可以提高诊断的特异性和敏感性。Sathe 等[11]应用高分辨质谱及TMT标记定量蛋白质组技术发现了AD患者脑脊液中139种差异蛋白，其中NPTX2联合PKM或YWHAG具有较好的诊断敏感性和特异性，这些差异蛋白质有可能成为AD病情进展及治疗的反应性监测指标。

2.3 颅脑缺血损伤 颅脑损伤其病程进展及预后往往难以预测，对其进行准确的早期诊断面临巨大的挑战，且目前尚无有效的治疗方法。钙结合蛋白S100B蛋白最近被确定为脑损伤诊断及预后的标志物[12]。使用定量基于MS 蛋白质组学方法，Hanrieder 等[13]发现重型颅脑损伤后急性期反应物水平升高，包括纤维蛋白原、神经元特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和胱抑素C，而脑脊液中S100B 无变化。Bao等[14]收集重度脑损伤患者慢性意识障碍病程不同时间段及健康人群血浆，对血浆样本进行iTRAQ 标记和分析，在颅脑损伤后鉴定出32种蛋白质有显著差异改变，并且这些差异蛋白主要参与补体系统通路。

2.4 神经发育畸形 神经管畸形(NTD)是儿童常见严重的神经系统先天畸形，发病率为1‰～5‰。该病由环境因素和遗传因素共同作用所致，其畸形的发病机制并不清楚，治疗效果不佳。Fan[15]等用双向电泳和质谱分析的方法对先天性脊柱裂胎鼠的脊髓组织进行了蛋白质表达谱的分析，鉴定出14种差异蛋白。Shan等[16]利用该方法结果在羊水中鉴定出7种差异蛋白质。Liu等[17]利用表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱筛选神经管缺陷胎儿母亲血清、尿液和羊水中差异蛋白，并结合分类与回归分析建立诊断模型，诊断神经管缺陷胎儿的灵敏度和特异度较高。An等[18]用iTRAQ结合质谱技术比较了NTD及正常妊娠孕鼠血清中差异蛋白，分别在致畸早期2个时间点鉴定得到40种和26种差异表达蛋白质，并且在孕妇血清中扩大样本验证PCSK9作为NTD产前诊断标志物具有较好的敏感性和特异性。Shen等[19]用MALDI-TOF-MS 技术比较了NTD妊娠与正常妊娠孕妇血清蛋白质的差异表达，经蛋白质指纹图谱软件发现3种蛋白诊断NTD的敏感性和特异性可达到96%和90%。

3 未来展望

近年来，蛋白质组学方法在神经系统疾病研究领域取得了长足的发展，神经系统疾病生物靶标的研究成为当今热点。未来我们期待在疾病早期就可以发现用于临床的以非侵入性检查获得的新的分子标志物，从而及早发现神经系统疾病。非侵入的生物靶标主要在体液中寻找，如血浆、尿液和脑脊液等，而脑脊液和大脑直接接触，因此脑脊液蛋白质组学对神经系统疾病的研究有很大价值。然而由于体液中含有大量的高丰度蛋白，难以鉴定出低丰度蛋白，因此发展对低丰度蛋白的富集技术，以便鉴定出更多的有价值的分子标志物至关重要。而实现生物靶标的临床应用还需要遵循蛋白质组学临床指南在多中心进行大样本的生物验证研究。