2012—2017年湖南省非结核分枝杆菌感染的特征分析

陈忠南 易松林 胡培磊 郭靖玮 余艳艳 刘彬彬 易环 杨坤云 谭云洪

非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)系指除结核分枝杆菌复合群(MTBC)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。目前，欧美国家和亚洲国家NTM肺病的发病率逐年上升，包括我国在内的亚洲地区，NTM的感染率也在上升[1]。NTM肺病具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部损伤表现，主要侵犯肺部。在无菌种鉴定结果的情况下，痰涂片抗酸染色和分枝杆菌培养难以区别NTM和结核分枝杆菌，造成痰涂片抗酸染色或分枝杆菌培养阳性患者误诊为结核病而持续地给予抗结核药物治疗，甚至误诊为耐药结核病而长期给予耐多药结核病方案进行治疗[2]。 NTM的分布具有明显的地域差异，不同地区的感染率、发病率和流行菌种各有特点[3]。笔者参考《结核病实验室诊断技术培训教程》[4]、《非结核分枝杆菌的菌种鉴定技术》[5]对2012—2017年湖南省经BACTEC MGIT 960培养分离出的分枝杆菌菌株采用MPB64蛋白免疫胶体金法、对硝基苯甲酸(PNB)生长试验进行MTBC与NTM初步鉴别，应用16S rRNA、Hsp65测序法将NTM鉴定到种水平，分析NTM感染患者的相关临床资料，以了解湖南省NTM的菌种分布、流行状况及趋势，为 NTM肺病的疫情监测及制定防控策略提供科学依据，以适应临床诊治工作的需要。

材料和方法

一、研究对象

收集2012—2017年来自湖南省14个地级市、经湖南省胸科医院行BACTEC MGIT 960 法确诊为分枝杆菌感染的患者15 576例，其中男性11 126例，女性4450例。分离出分枝杆菌菌株15 576株(每例患者1株)。H37RV标准菌株来源于中国疾病预防控制中心结核病控制中心国家结核病参比实验室。

二、试剂与仪器

4%NaOH、pH值为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)按照《结核病实验室诊断技术培训教程》[4]的规程由科室自配；BACTEC MGIT 960分枝杆菌分析系统(简称MGIT 960)及其配套试剂MGIT 试管(含7H9 液体培基)、油酸-白蛋白-右旋糖-过氧化氢酶(OADC)添加剂(含营养液)、杂菌抑制剂购自美国 BD公司；萋-尼抗酸染色试剂、改良罗氏培养基、PNB培养基购自珠海贝索生物技术有限公司；结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(MPB64蛋白免疫胶体金法)购自杭州创新生物检控技术有限公司。采用16S rRNA和Hsp65两个同源序列分析及斑点杂交方法将NTM鉴定到种水平，引物合成及测序由北京瑞博生物有限公司完成，所有试剂均在有效期内使用。

三、研究方法

(一)MGIT 960分离培养

培养按照《结核病实验室检验规程》[6]进行，仪器报阳培养标本进行萋-尼抗酸涂片染色，抗酸染色阳性报告“分枝杆菌培养阳性”。

(二)MTBC与NTM初步鉴定

1.MPB64蛋白免疫胶体金法：MGIT 960 系统分离培养的阳性菌株直接应用其液体培养基上清液进行检测。吸取上述待测菌液 0.1 ml 加入试剂检测板上的加样孔，15～60 min观察检测结果。检测线和质控线均出现紫红色条带，判定为阳性；检测线未出现紫红色条带，质控线出现弱紫红色条带，判定为疑似阳性；检测线未出现紫红色条带，质控线出现紫红色条带，判定为阴性；检测线和质控线双方均未出现紫红色条带，判定为无效。

2. PNB生长试验：取100 μl经MPB64蛋白免疫胶体金法鉴定为阴性的MGIT 960 系统分离培养阳性菌液，接种于改良罗氏培养基和PNB培养基生长管内，置入37 ℃恒温培养箱进行培养。改良罗氏培养基有分枝杆菌生长、PNB培养基无分枝杆菌生长为MTBC；改良罗氏培养基与PNB培养基均有分枝杆菌生长为NTM。

(三)NTM菌种鉴定

由于实验室条件有限，且部分菌株丢失，对初步鉴定为NTM的菌株全部开展菌种鉴定工作始于2016年，具体操作步骤如下：

1．细菌DNA的制备：用接种环取改良罗氏培养基上生长的分枝杆菌1～2环菌落，溶于500 μl生理盐水中，85 ℃灭活20 min；离心半径8.5 cm，12 000 r/min 离心5 min，弃上清，菌体沉淀用500 μl 无菌纯水中重悬洗涤；然后离心半径8.5 cm，12 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入50 μl无菌纯水，95 ℃ 金属浴10 min，之后超声处理15 min。离心半径8.5 cm，12 000 r/min 离心5 min，取上清备用(-20 ℃ 冷冻保存)。

2. 聚合酶链式反应(PCR)及分子测序技术：采用16S rRNA、Hsp65两对引物扩增，16S rRNA上游引物为：5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAA-GG-3′；下游引物为5′-GCCCGTA-TCGCCCGCACGCT-3′。Hsp65上游引物: 5′ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′，下游引物: 5′-CTTGTC-GAACCGCATACCCT-3′，由北京瑞博生物有限公司合成。16S rRNA产物800 bp, Hsp65产物400 bp；PCR反应体系 50 μl：上游、下游引物各 1.5 μl，2×Taq PCR Master Mix 25 μl，ddH2O 20 μl，DNA 2 μl，同时取两管PCR反应管分别加入结核分枝杆菌阳性质控品和结核分枝杆菌阴性质控品。按如下程序扩增：预变性95 ℃ 5 min，1个循环; 变性94 ℃ 35 s，退火60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；延伸72 ℃ 8 min，1个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳40 min，采用凝胶成像系统扫描摄影，条带需明亮单一，否则进一步纯化。PCR扩增产物送北京瑞博生物有限公司进行测序，利用生物数据分析软件(BLAST)将测序得到的基因序列与美国国立生物技术信息中心 (NCBI)网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做同源性比较，相似度≥97%即可确定菌种。

3. 斑点杂交技术：测序失败菌株则应用亚能生物技术(深圳)有限公司研制的分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒进行检测, 检测方法为斑点杂交法，具体操作步骤参照说明书。

结 果

一、NTM的分离情况

分离培养出15 576株分枝杆菌菌株中，MPB 64抗原检测阳性13 550株、阴性2026株，经PNB生长试验鉴定后，MPB64抗原阴性标本中鉴定出NTM 1584株、MTBC 442株。2012—2017年NTM检出率见表1。

二、 NTM感染者性别、年龄、职业分布

2012—2017年湖南省14个地级市NTM感染者中，男性占62.06%(983/1584)，女性占37.94%(601/1584)，且各年NTM感染者均为男性多于女性；各年龄组NTM感染者分布显示，40～岁的中老年患者为感染高峰人群(39.02%，618/1584)；各类职业分布显示，NTM感染者均以农民为主(66.67%，1056/1584)，见表2。

表1 2012—2017年湖南省14个地级市NTM检出情况

三、NTM菌种分布特征

2016年共鉴定出333株NTM及3例MTBC与NTM混合感染。333株NTM菌种分布达 24种，菌种分布位列前4者分别为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌，分别占25.23%、24.62%、18.62%、16.82%(表3)。其他49株(14.71%)NTM，包含20种NTM，分别为偶发分枝杆菌9株，蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌各5株，缓黄分枝杆菌、新金分枝杆菌各4株，外来分枝杆菌、三重分枝杆菌各3株，马赛分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌各2株，另10种分枝杆菌各1株。3例混合感染者，分别为结核分枝杆菌+脓肿分枝杆菌、结核分枝杆菌+胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌+蟾蜍分枝杆菌。

2017年NTM菌种共有383株，包括21种类型，菌种分布位列前4者仍然为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌，鸟分枝杆菌，分别占27.15%，22.46%，21.15%，17.49%(表3)。其他45株(11.75%)NTM，包含17种NTM，分别为偶发分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌各8株，瘰疬分枝杆菌6株，堪萨斯分枝杆菌、马赛分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌各3株，摩纳哥分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、新金分枝杆菌各2株，另8种分枝杆菌各1株。

讨 论

NTM广泛存在于水、土壤、灰尘等自然环境中，其中部分为致病菌或条件致病菌，目前NTM肺病的发病率及流行率在世界范围内呈上升趋势[7]。由于NTM肺病无传染性，大多数国家并不强制报告，因此监测数据不仅有限且不可靠[8]。陈闯等[9]通过中国知网和万方数据库检索的2010年前后NTM感染相关论文得出，除了浙江省、广东省的 NTM 检出率高于 20%外，其他地区的NTM检出率均低于20%；其中上海市、陕西省、河北省、四川省的 NTM 检出率虽处于较高水平，但也仅在 10%左右，而山东省、云南省、西藏、新疆、河南省、湖北省，以及哈尔滨市和吉林市等东北地区报告的 NTM 检出率仅为5%左右。本研究统计结果显示，近6年湖南省14个地级市NTM检出率为10.17%，处在全国较高水平。

表2 NTM感染者不同特征在2012—2017年的分布情况

表3 NTM不同菌种类型在2016—2017年中的分布情况

近年来，NTM 的临床实验室检出率有所增加，这与现代细菌学方法的快速鉴别诊断密切相关。随着免疫检测技术和分子生物技术的发展，NTM的鉴定技术也取得很大的进步。但目前我国对NTM的诊断没有建立早期、快速、敏感和特异的标准化诊断技术[8]。传统PNB生长试验鉴别MTBC与NTM的能力较强，但耗时较长，且不能将NTM鉴定到种水平[4]。MPB64 蛋白免疫胶体金法的检测原理是利用MPB64抗原是MTBC在液体培养基中生长时主要的分泌蛋白之一，NTM在培养滤液中多不存在此分泌蛋白，由此将MTBC与NTM进行初步的菌种鉴定[5]。MPB64蛋白免疫胶体金法操作简单、用时短、不需特殊设备，但也存在部分结核分枝杆菌不分泌MPB64蛋白，因此有部分MTBC的MPB64抗原检测呈阴性[10]。本研究采用MPB64蛋白免疫胶体金法将分枝杆菌快速鉴别出大部分MTBC，同时应用PNB生长试验鉴定出NTM及少部分MPB64抗原呈阴性的MTBC。本研究在进行分枝杆菌初步鉴定时采用MPB64蛋白免疫胶体金法与PNB生长试验两种方法结合，既节省了大部分分枝杆菌的初步鉴定时间，又防止部分MPB64呈阴性的MTBC被误诊为NTM。2013年之前我院对MGIT 960培养阳性培养物主要靠抗酸染色涂片，存在部分NTM被误诊为MTBC的情况；采用MPB64蛋白免疫胶体金法与PNB生长试验两种方法对菌株进行初步鉴定可以减少误诊和漏诊。

本研究发现2012—2017年NTM感染者均以男性为主，这与罗春明等[11]和杨栗坤等[12]的研究结果一致。另外，2012—2017年间NTM感染患者主要为>40岁的中老年农民，出现这种情况的原因可能为NTM 广泛存在于自然界，人与某些动物均可从环境中感染NTM而致病，水和土壤是重要的传播途径[3]。有文献报道表明，感染NTM的危险因素与男性吸烟、人口老龄化、免疫抑制人群增多及环境暴露等因素有关[13]。

本研究依据《结核病实验室诊断技术培训教程》[4]、应用16S rRNA、Hsp65测序法进行菌种鉴定。考虑到部分测序结果出现双峰，有可能存在混合感染现象[14]，故采用斑点杂交法再次检测出现双峰的标本。2016、2017年菌种鉴定结果显示，菌种分布达 24种，位列前4者分别为：胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌，鸟分枝杆菌，这与我院2011年的分析数据[15]及福建省[16]、浙江省[17]的菌种分布类似。同时采用斑点杂交法鉴定出3例混合感染，为临床难治性混合感染患者的进一步治疗提供了可靠的实验室依据。段鸿飞[18]研究认为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌为致病菌,分离出戈登分枝杆菌有可能是患者标本被NTM污染且并不致病。因此，对于湖南省14个市检出的戈登分枝杆菌是否为标本污染菌、是否导致疾病，还需做进一步的深入研究。

笔者单位作为全省的结核病防治定点专科医院，具有来自全省14个地级市的大样本，且初步总结了近6年内NTM的检出率、易感人群，以及近2年的NTM菌种分布特征，因此本研究可为了解湖南省NTM的感染现状提供一定的参考依据。但本研究也存在一定的局限性，由于受当时实验人员不熟悉菌种测序工作及菌株未保存完整等实验条件的限制，我院只在2016年之后将全部NTM菌株鉴定到种水平。因此，为更好地做好NTM感染的防治工作，还需继续监测湖南省NTM感染的菌种分布情况。