三种快速检测技术诊断早期结核性脑膜炎的评价
2019-02-13郑立恒柳晓金冯建纯章志华何红彦邵艳新陈颜强
郑立恒 柳晓金 冯建纯 章志华 何红彦 邵艳新 陈颜强
结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最严重的肺外结核，占所有结核病的0.5%～1.0%[1]，病死率可达26.8%[2]，生存者中20%～30%有永久性后遗症[3]。在临床诊治中，由于患者临床表现缺乏特异性，病原学阳性检出率极低[4]，误诊误治、延误治疗的情况常见[5]。TBM患者的预后依赖于早期快速诊断，所以寻找早期快速准确的诊断方法一直是临床上亟待解决的问题[6]。2012年Chen等[7]应用改良抗酸染色法对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的诊断是里程碑性的变革，但是操作比较繁琐；本研究在此基础上进一步将操作流程进行简化。2010年，WHO推荐将GeneXpert MTB/RIF技术(简称“GeneXpert技术”)作为肺结核首选筛查方法，然而其对TBM的诊断价值尚不明确，未见大样本的相关研究[8]。为此，对河北省胸科医院和石家庄市第五医院收治并临床确诊的45例TBM患者和42例非TBM患者的脑脊液同时进行离心涂片抗酸染色、改良抗酸染色法和GeneXpert技术检测，并对这3种方法的检测结果进行分析，为临床诊断提供相关数据，以指导临床选择实用、有效的检测方法。
资料和方法
一、临床资料
搜集2016年8月至2018年6月河北省胸科医院和石家庄市第五医院收治并临床确诊的45例TBM及42例非TBM患者，其中，男61例、女26例，年龄18～81岁，平均年龄(36.2±9.7)岁。
按照最新的TBM诊断标准[8]，根据临床表现、头颅影像学、脑脊液及脑外结核灶的证据进行评分，将患者分为以下4类：(1)确诊的TBM：符合临床诊断标准，同时脑脊液结核分枝杆菌培养阳性或检出抗酸杆菌或核酸检测阳性；(2)很可能的TBM：符合临床诊断标准，同时评分≥10分(没有神经系统影像学表现)或临床评分≥12分(有神经系统影像学表现)，且脑脊液或神经影像学评分≥2分，同时排除其他类型脑膜炎；(3)可能的TBM：符合临床诊断标准，且临床评分为6～9分(没有神经系统影像学表现)或临床评分为9～11分(有神经系统影像学表现)，而未行脑脊液检查或头颅影像学检查的不能确定诊断；(4)非TBM：不符合临床诊断标准，未进行抗结核药物治疗，排除了TBM的其他确定性诊断。
按照上述标准，临床诊断为TBM患者共计45例(为“确诊的TBM+很可能的TBM”)、非TBM患者共计42例；非TBM组患者中包括隐球菌性脑膜炎10例、病毒性脑膜炎27例、脑出血5例。
二、仪器与试剂
二级生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司产品)，抗酸染液(珠海贝索生物技术有限公司产品)，显微镜(日本Olympus公司产品)，Cytospin-4型细胞离心沉淀仪(英国Thermo公司产品)，GeneXpert MTB/RIF仪器及配套试剂(美国Cepheid 公司产品)。
三、研究方法
1. 标本留取：所有患者在用药前进行腰椎穿刺术，留取脑脊液5～10 ml，同时采用离心涂片抗酸染色法、改良抗酸染色法、GeneXpert技术进行检测。
2. 离心涂片抗酸染色检测：将脑脊液2～4 ml加入至无菌一次性试管中，采用1360×g离心10 min，轻轻吸出上清液弃掉，反复吹打试管底部沉渣进行涂片，涂片面积1 cm×2 cm，然后按照《结核病诊断实验室检验规程》[9]进行抗酸染色及油镜镜检。
3. 改良抗酸染色检测：脑脊液充分混匀，取0.5 ml 加入Cytospin-4型细胞玻片离心沉淀仪中，采用28×g离心5～8 min；然后取出沉淀均匀涂在玻片上，待自然干燥后直接进行抗酸染色及镜检。
4. GeneXpert技术检测：脑脊液充分混匀后直接取2 ml加入反应盒中，然后插入检测平台，输入患者和标本相关信息后开始运行。仪器会自动检测荧光信号，结果判定依据循环阈值(Ct值)的高(Ct≤16)、中(16
四、统计学处理
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验、校正χ2检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
以临床诊断为标准，离心涂片抗酸染色法、改良抗酸染色法、GeneXpert技术检测87例患者脑脊液诊断TBM的敏感度分别为4.44%(2/45)、88.89%(40/45)、35.56%(16/45)，特异度均为100.00%；改良抗酸染色法与离心涂片抗酸染色法的敏感度比较，差异有统计学意义(χ2=64.46，P=0.000)；改良抗酸染色法与GeneXpert技术敏感度相比，差异有统计学意义(χ2=27.23，P=0.000)；GeneXpert技术与离心涂片抗酸染色法敏感度比较，差异有统计学意义(χ2=13.16，P=0.000)；改良抗酸染色检测分枝杆菌阳性预测值为100.00%，阴性预测值为89.36%(表1)。
讨 论
TBM是由MTB引起的非化脓性炎性反应，是结核病患者死亡的主要原因之一[11]。TBM的诊断多数为通过临床表现、脑脊液常规生化检测、头颅影像学及是否有颅外结核病灶等综合分析后做出的临床诊断，极少能够找到病原学证据，误诊情况常见，有文献报道误诊率可高达50.73%[12]。其主要原因是长期以来TBM病原学检测技术的瓶颈问题难以突破，但是TBM的早期诊断、规范治疗是显著改善患者预后、降低致残率及致死率的关键[13]。
2009年全球41位专家在南非开普敦提出TBM诊断专家共识[8]，指出确诊TBM除了符合临床诊断标准，同时应具备符合以下一项或多项标准：(1)脑脊液中查到抗酸杆菌；(2)脑脊液MTB培养阳性；(3)脑脊液MTB核酸检测阳性；(4)脑组织或脊髓中发现抗酸杆菌或结核性病理改变[8]。由于颅脑是重要神经中枢，不会轻易进行脑组织及脊髓活检，在临床工作中极少行该方面的检查。确诊TBM目前多采用抗酸染色、MTB培养和分子学检测。脑脊液离心涂片抗酸染色检测的敏感度极低，远远低于文献报道的其他检测技术的敏感度；MTB培养所需时间长、阳性率低，不能做到及时诊断；普通的PCR技术特异度差，假阴性和假阳性问题一直无法解决。因此，TBM的早期及时诊断极为困难[14]。研究与开发特异度和敏感度高并适合临床推广的早期TBM诊断方法是一个迫在眉睫的问题。
表1 以临床诊断为标准3种技术对87例患者脑脊液检测诊断TBM的效能比较
注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%
离心涂片抗酸染色法已经应用了很多年，虽然简便、快速、经济，但是检出分枝杆菌的阳性率极低，不能满足临床需要。其主要原因是：(1)脑脊液所处位置特殊，决定了其中的MTB的荷菌量极低，但是普通抗酸染色检测阳性则要求脑脊液的荷菌量达到5000～10 000条/ml，故阳性率不可能太高；(2)脑脊液每次取出的量是有限的，不可能一次性进行大量的采集，所以可以收集到的菌量很少，增加标本量可以提高阳性率，但是不可行；(3)MTB的比重小于脑脊液的比重，离心时受到浮力的作用，不易完全沉到管底，弃掉上清时可造成细菌的丢失；(4)离心后转移涂片时本来菌量很少的细菌不可能完全转移出来，使阳性率进一步降低；(5)抗酸染色涂片面积为1 cm×2 cm，显微镜下大约有10 000个视野，但是阅片只看300个视野，大部分观察面积被遗漏，亦会降低阳性率。文献报道脑脊液离心涂片抗酸染色法检测的阳性率在10%左右[15-16]，本研究TBM组中离心涂片抗酸染色法检测抗酸杆菌的检出率为4.44%，较文献报道偏低。
2012年，改良抗酸染色法的应用是一个里程碑式的进步，此法应用细胞玻片离心沉淀仪浓集脑脊液白细胞和病原菌后再进行抗酸染色。研究结果显示，脑脊液标本分枝杆菌培养阳性患者采用改良抗酸染色法的抗酸杆菌检出率为100.00%，其中大多数标本可检出细胞内的抗酸杆菌[7]。文献研究表明，改良抗酸染色法检测阳性率高的原因是：(1)用 4%多聚赖氨酸固定玻片15 min，有利于MTB黏附在玻片上，在染色过程中可减少细菌的丢失；(2)制片后用固定液固定15 min，有利于保持细胞的正常形态，便于观察被吞噬的MTB；(3)0.3%的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)浸泡30 min以破坏白细胞胞膜，有利于对被吞噬的MTB染色。
本研究应用改良抗酸染色法后阳性率明显提高，但过程耗时耗力，检测一个标本需要将近2 h。工作中发现抗酸杆菌基本都在细胞外，故简化步骤为利用玻片离心沉淀仪浓集细胞和分枝杆菌后直接进行抗酸染色，节省了固定和破膜的45 min，比传统的离心涂片抗酸染色更节省时间，效果更好。阳性率高的原因为：(1)离心过程中脑脊液被滤纸吸收，不存在离心时浮力的问题；(2)有形成分直接沉淀到玻片上，不存在转移损失问题；(3)沉淀面积很小，病原菌得到了高度浓集；(4)较发表的改良抗酸染色法[7]处理步骤更少，进一步减少了病原菌的丢失。简化后的改良抗酸染色法TBM组检出率(88.89%)明显高于离心涂片抗酸染色(4.44%)和GeneXpert技术(35.56%)。
GeneXpert技术是半巢氏实时荧光定量PCR技术，可对MTB进行检测，检出限为131菌落形成单位(CFU)/ml[17]，其为结核病的早期诊断提供了高效的确诊方法；为WHO推荐使用的用于MTB及利福平耐药快速检测技术，具有操作简便、快速、敏感度高、特异度强等特点[18-19]。自应用以来得到了肺结核及耐药肺结核诊断领域专家的广泛认可，但其对肺外结核的研究相对较少，诊断价值还待进一步研究。相关研究的Meta分析显示，此技术在肺外结核诊断中的敏感度为25%～96%左右，特异度几乎为100%；但是其对脑脊液、胸腹腔积液、关节液、心包积液等不同标本的敏感度有较高的异质性，需要进行更为深入的研究[20-21]。本研究采用GeneXpert技术检测临床确诊为TBM患者的脑脊液，MTB的阳性检出率(35.56%)高于离心涂片抗酸染色法(4.44%)对分枝杆菌的检出率，高于邹月丽等[22]报道确诊MTB组的23.68%。其原因可能是：(1)本研究入选TBM患者时标准非常严格；(2)操作步骤不是按照痰液等标本那样还需加入消化液，这样会稀释脑脊液中荷菌量本来就很低的MTB，因为脑脊液里面蛋白含量低，没有可见凝块，本研究直接取混匀的2 ml脑脊液加入反应盒中进行检测。
以临床诊断为标准，本研究3种检测方法的特异度均为100.00%，改良抗酸染色和GeneXpert技术检测TBM的敏感度较高，其原因可能是：(1)本研究样本量(仅87例)较少；(2)操作人员受到严格的训练，操作规范，形态学识别能力强；(3)研究组多年从事TBM研究，入组患者选择比较严格。以后还要扩大样本量进行更深入的研究。
综上所述，离心涂片抗酸染色法检测患者脑脊液的阳性率极低，对TBM的早期诊断意义不大。进一步简化的改良抗酸染色法明显提高了TBM患者脑脊液中分枝杆菌的检出率；但是很多单位对此技术还不了解，在许多省份中还是空白。改良抗酸染色法操作简便、实验室条件要求相对较低，亟待推广使用，其缺点是不能区分抗酸杆菌是结核还是非结核分枝杆菌。GeneXpert技术是个有益的补充，但该技术要求标本的荷菌量达到100～200条/ml，其虽然没有改良抗酸染色法敏感度高，但是可以区分结核与非结核分枝杆菌。
