关于猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法与临床应用的探讨

马 兰

（哈尔滨维科生物技术有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

猪瘟病毒是一种小型单链RNA病毒，与牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral dirhea virus，BVDV）及羊边界病毒（Borger disease virus，BVD）均属于黄病毒科瘟病毒属。而近年发展的实时荧光定量PCR （Real-time fluorescent quantitativePCR）技术由于快速检测微量的病毒核酸，可以准确的确定病毒拷贝数的样本，操作方便，耗时短，结果直观，这么快就被广泛使用在农业、医学领域。本文通过反复试验，成功建立了一种实时荧光RT-PCR检测特异性CSFV的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和样品

从中牧实业股份有限公司购买猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖呼吸综合征病毒（PRSV）、猪O型口蹄疫病毒（O-FMDV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒II型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）等灭活疫苗，这些灭活疫苗经多次冻融处理后，应用RNA/DNA提取。

1.1.2 主要试剂与仪器设备

主要试剂：磁珠法全自动核酸提取试剂盒、世纪元亨猪瘟通用型实时荧光RT-PCR试剂盒；仪器：MagMAXTMExpress核酸提取仪、AB17500实时荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 模板准备

在MagMAXTMExpress核酸提取仪的帮助下，按照磁珠自动核酸提取试剂盒的说明书提取PPVAPRVAPCV2的DNA和o=fmdvAPRRSVACSFV的RNA。提取的DNA/RNA用于PCR扩增或-20c保存备用。

1.2.2 精密度试验

精密吸取浓度为1.000mg/mL的CSFV 1uL，作为实验模板，连续进样6次。x轴为CT值，y轴为Rn，用于CSFV实时荧光定量PCR方法的精密度验证。

1.2.3 准确度试验

精密量取含有CSFV病毒的样本和不含CSFV病毒的样本各6份，每份1μl，浓度为1.000mg/ml，送至具有实时荧光RT-PCR检测能力的实验室进行比对检测。

1.2.4 特异性试验

以选择的反应体系和条件为参照，扩增模板中制备的PPV、PRV、PCV2、o-fmdv、PRRSV、CSFV的DNA，并设置阴性对照和阳性对照。

2 结果

2.1 精密度试验

精密度检测结果显示：第一次检测CT值为23.1、第二次检测CT值为23.2、第三次检测CT值为23.3、第四次检测CT值为23.2、第五次检测CT值为23.6、第六次检测CT值为23.5，变异系数为1.10%。

2.2 准确度试验

与设计的一组样本相比，测试结果基本一致，具有较好的CSFV检测精度。

2.3 特异性试验

用本文方法扩增含有CSFV的疫苗时，会出现阳性扩增信号，而PPV、PRV、PCV2、0-fmdv、PRRSV的核酸模板没有出现阳性扩增，说明该方法具有较好的特异性。

3 讨论

对于中国养猪业而言，CSFV所造成的危害十分严重。目前，我国有大量的CSFV疫苗生产企业，但生产的疫苗质量差异非常明显，往往出现免疫失败。此外，CSFV的临床表现十分复杂，缺乏典型病例。快速、特异、灵敏的分子生物学诊断方法的发展，有利于CSFV的快速检测、CSFV病原阳性猪的清除和猪瘟的纯化。将样品中总RNA提取样品，以样品中的mRNA为模板。利用0ligo （dT）或随机引物将逆转录酶转录成cDNA，然后以cDNA为模板将PCR进行扩增，建立和应用猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测，可以检测到多种CSFV阳性样品，但没有CSFV的其他样品没有特异性扩增，准确度和精密度的检测结果也是有效的，表明该方法具有较好的特异性、精密度和准确度。

综上所述，猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法，敏感性.特异性、准确性好，是了解猪瘟病疫情流行状况的有效手段，有助于更好地控制猪瘟的感染和流行。