长链非编码RNA TMCC1-AS1在人肝癌细胞株中的表达及对SMMC-7721细胞增殖迁移能力影响观察

程涛，姚远，张生，张向宁，张爱辉，杨威，侯崇智

(1 西安市儿童医院，西安710002；2 西安交通大学第一附属医院)

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 bp的非编码RNA分子，可通过在转录、翻译、染色质以及表观遗传学水平调控基因表达，进而参与各类生物学过程[1]。研究[2,3]发现，lncRNA可通过影响多种肿瘤细胞生物学过程参与肝癌的发生发展。通过生物信息学对肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中肝癌临床样本的转录组测序数据进行分析，发现位于3号染色体3q22.1区段的一条lncRNA TMCC1-AS1在肝癌组织中呈高表达且与生存期负相关，提示TMCC1-AS1可能参与肝癌的发生发展，但生物学功能未见报道[4,5]。2018年6月～2018年12月，我们观察了TMCC1-AS1在不同人肝癌细胞株和正常人肝细胞中的表达变化及沉默TMCC1-AS1对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖、细胞周期、迁移的影响，探讨TMCC1-AS1在肝癌发生发展中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂 人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝细胞株HL-7702均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。TMCC1-AS1干扰RNA(siTMCC1-AS1)及阴性对照干扰RNA(siNC)均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，RNA提取试剂RNAiso Plus购自日本TAKARA公司，转染试剂PowerFectTM购自美国SignaGen公司，反转录试剂HiFiScript cDNA Synthesis Kit和实时荧光定量试剂FastSYBR Mixture购自江苏康为世纪生物科技有限公司，CCK-8试剂购自日本DOJINDO公司，细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell小室(8 μm)购自美国康宁公司，DMEM培养液、胎牛血清及青霉素链霉素双抗均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 人肝癌细胞株与正常肝细胞中TMCC1-AS1的检测 人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝细胞株HL-7702均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2条件下在恒温培养箱中培养。采用RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA，随后分别采用反转录试剂HiFiScript cDNA Synthesis Kit和实时荧光定量试剂FastSYBR Mixture进行逆转录和qRT-PCR反应。TMCC1-AS1上游引物为5′-GCCAGAGCGACGGTTGGA-3′，下游引物为5′-GGCTGCGTTCGATGGGTG-3′；以GAPDH为内参，其上游引物为5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3′，下游引物为5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3′。PCR反应体系共50 μL：2×FastSYBR Mixture 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性20 s，95 ℃变性3 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。以2-ΔΔCt表示细胞中TMCC1-AS1的相对表达量。

1.3 SMMC-7721细胞的TMCC1-AS1 siRNA转染及转染后细胞增殖能力、细胞周期比例、迁移能力观察

1.3.1 SMMC-7721细胞的TMCC1-AS1 siRNA转染及分组 将SMMC-7721细胞以1×106个/孔接种于6孔培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，待细胞融合度达到30%～50%时，参照PowerFectTM试剂说明书分别转染siTMCC1-AS1及阴性对照siNC，分别记为沉默组和对照组。两组细胞转染48 h后，参照“1.2”检测转染后两组细胞中TMCC1-AS1的相对表达量。

1.3.2 转染后两组SMMC-7721细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。两组细胞转染24 h后，胰酶消化收集细胞，用完全细胞培养液重悬，以2 000个/孔的密度接种于96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。两组各设置4行(分别对应4个时间点)，每行5个复孔，分别于培养24、48、72、96 h时，加入10 μL CCK-8试剂，于37 ℃培养箱中继续孵育1.5 h后，采用酶标仪检测450 nm处各孔的光密度(OD)值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.3.3 转染后两组SMMC-7721细胞周期比例观察 采用流式细胞术。两组细胞转染48 h后，以1×106个/孔密度接种于6孔板中，用预冷的75%乙醇于4 ℃条件下固定过夜，PBS洗涤细胞后，采用细胞周期检测试剂盒中的碘化丙啶(PI)染色液避光孵育25 min，上流式细胞仪检测两组细胞周期，采用FlowJo软件分析处于不同周期的细胞比例。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 转染后两组SMMC-7721细胞迁移能力观察 采用Transwell小室法。两组细胞转染24 h后，收集细胞用无血清细胞培养液重悬，以50 000个/孔的密度接种于Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的细胞培养液作为趋化介质，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞并用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签小心擦掉Transwell膜内层未迁移细胞，于倒置显微镜下观察迁移细胞数，以迁移细胞数表示细胞迁移能力。每组随机取5个视野计数，取平均值。

2 结果

2.1 人肝癌细胞株与正常肝细胞中TMCC1-AS1相对表达量比较 人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝细胞株HL-7702中TMCC1-AS1相对表达量分别为3.450±0.309、5.340±0.535、4.270±0.252和1.000±0.068，人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7中TMCC1-AS1相对表达量与正常人肝细胞株HL-7702相比，P均<0.01。

2.2 转染后两组SMMC-7721细胞中TMCC1-AS1相对表达量比较 沉默组SMMC-7721细胞中TMCC1-AS1相对表达量为0.34±0.11，对照组为1.00±0.04，两组相比，P<0.01，提示沉默TMCC1-AS1的SMMC-7721细胞模型成功建立。

2.3 转染后两组SMMC-7721细胞增殖能力比较 沉默组培养24、48、72、96 h时的OD值分别为0.316±0.028、0.402±0.033、0.726±0.065、0.934±0.073，对照组培养24、48、72、96 h时的OD值分别为0.362±0.031、0.613±0.048、1.025±0.083、1.384±0.115，两组相比，P均<0.05。

2.4 转染后两组SMMC-7721细胞周期比例比较 沉默组G0/G1期、S期细胞比例分别为62.6%±3.7%、20.4%±1.8%，对照组G0/G1期、S期细胞比例分别为54.4%±3.9%、26.5%±1.9%，两组相比，P均<0.01；沉默组G2/M期细胞比例为16.4%±1.5%，对照组G2/M期细胞比例为17.6%±1.9%，两组相比，P>0.05。

2.5 转染后两组SMMC-7721细胞迁移能力比较 沉默组与对照组细胞迁移数量分别为(112±11)个和(188±13)个，两组相比，P<0.01。

3 讨论

肝癌作为临床上最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率在所有肿瘤中居第6位，而死亡率则居第4位。目前认为，肝癌发生与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、长期酗酒、肝硬化、黄曲霉毒素摄入、代谢性疾病等因素密切相关，但其确切的发病机制，尤其是分子机制仍不清楚[6]。因此，解析肝癌发生发展分子机制、开发有效的早期诊断和预后标志物以及治疗靶点显的十分迫切和必要。

近年来研究[7,8]发现，lncRNA作为一类新型的调控分子，在各种肿瘤组织和细胞中异常表达，发挥致癌作用或抑癌作用，其可通过复杂的调控机制参与包括肝癌在内的各类肿瘤的发生发展。目前，已有一大批肝癌相关lncRNAs被鉴定出来，发现其在肝癌组织和细胞中表达失调，其可通过作用细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等多种生物学过程参与肝癌的发生发展[9]。研究[10～13]发现，HULC作为一条经典的肝癌相关lncRNA，在肝癌组织和细胞中表达上调，可通过调控miR-372、p18、SPHK1、ZEB1、USP22、COX-2和HMGA2等下游分子，影响肝癌细胞的增殖、上皮-间质转化、血管新生、转移、自噬、化疗耐药等肿瘤生物学行为。研究[14～18]显示，HOTAIR作为经典的促癌lncRNA，可通过调控SETD2、SUZ12、ZNF198、P14、P16、GLUT1、MMP9、ATG3和ATG7等分子的表达，进而影响肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移、葡萄糖代谢、自噬等生物学特性。

TMCC1-AS1是一条长度为3 497 bp的lncRNA，在人类基因组上与蛋白编码基因TMCC1呈头对头排列，二者启动子区域重叠，转录方向相反。Cui等[4]对TCGA和GEO数据库中肝癌和正常肝组织的转录组测序数据和临床病例资料进行生物信息学分析，发现TMCC1-AS1在肝癌组织中表达上调，其表达水平与患者生存期呈负相关。在另一项研究中，Zhao等[5]对TCGA数据库中370例肝癌组织和50例癌旁组织的lncRNA表达谱数据和临床资料进行分析，同样发现了TMCC1-AS1在肝癌组织中呈高表达，并通过多变量比例风险回归分析进一步发现TMCC1-AS1的表达水平与患者的总生存期呈负相关，可作为独立的预后判断指标。以上基于生物信息学的研究结果提示，TMCC1-AS1可能作为促癌lncRNA参与肝癌的发生发展，但目前仍缺乏直接的生物学实验证据。本研究首先检测了TMCC1-AS1在不同人肝癌细胞株中的表达情况，结果显示人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7中TMCC1-AS1相对表达量均高于正常人肝细胞株HL-7702，表明TMCC1-AS1可能作为促癌lncRNA参与肝癌发生发展。本研究进一步利用RNA干扰技术沉默了SMMC-7721细胞的TMCC1-AS1表达水平，并对细胞增殖能力、细胞周期变化及迁移能力进行检测，结果显示，沉默TMCC1-AS1可抑制SMMC-7721细胞的增殖、迁移能力，并诱导细胞周期阻滞于G0/G1期。总之，本研究结果表明，TMCC1-AS1在人肝癌细胞株中的上调表达与细胞的恶性肿瘤生物学行为密切相关，其可能通过调控细胞增殖与迁移进而参与肝癌的发生与发展。

综上所述，TMCC1-AS1在人肝癌细胞株中表达上调；沉默TMCC1-AS1可抑制人肝癌细胞株的增殖和迁移。本研究初步明确了TMCC1-AS1在肝癌发生发展中的生物学功能，为进一步探讨其作用机制提供了依据。